Effects of norfloxacin on nitrate reduction and dynamic denitrifying enzymes activities in groundwater

諾氟沙星對地下水硝酸鹽還原及動態(tài)反硝化酶活性的影響

來源：Environmental Pollution 273 (2021) 116492

 

一、摘要概述

 

本研究揭示了氟喹諾酮類抗生素諾氟沙星（Norfloxacin）對地下水反硝化過程的抑制機(jī)制：

 

核心發(fā)現(xiàn)：

 

諾氟沙星（0–100 μg/L）顯著抑制硝酸鹽（NO??）去除率（從0.68降至0.44 mg/L/h），并增加N?O排放177倍（圖2）。

 

100 μg/L諾氟沙星使亞硝酸鹽（NO??）積累減少50.6%，但加劇溫室氣體N?O釋放（圖2d）。

 

機(jī)制解析：

 

抑制細(xì)菌生長（OD???下降至對照的70.4%）、碳源利用（降低35.1%）及電子傳遞系統(tǒng)活性（ETSA降低43.3%）（圖1, 3）。

 

 

 

動態(tài)酶活監(jiān)測顯示：諾氟沙星抑制硝酸還原酶（NAR）活性，但增強(qiáng)亞硝酸還原酶（NIR）活性（圖4）。

 

 

基因表達(dá)分析：下調(diào)narG、nirS/nirK表達(dá)，上調(diào)norB基因，導(dǎo)致N?O還原受阻（圖5）。

 

 

技術(shù)亮點：首次通過動態(tài)酶活監(jiān)測揭示抗生素對反硝化酶的差異抑制效應(yīng)。

 

二、研究目的

 

評估生態(tài)風(fēng)險：明確諾氟沙星（地下水常見污染物，濃度達(dá)μg/L級）對反硝化過程的干擾（引言）。

 

揭示抑制機(jī)制：從細(xì)菌生長、碳代謝、電子傳遞、酶活性及基因表達(dá)多維度解析作用路徑。

 

創(chuàng)新方法：引入動態(tài)酶活監(jiān)測技術(shù)，量化NAR與NIR對諾氟沙星的敏感性差異（方法2.4）。

 

三、研究思路

 

采用 多尺度整合策略：

1. 實驗設(shè)計

 

菌源與培養(yǎng)：從潮白河含水層分離反硝化菌（93.5%為Acinetobacter），在模擬地下水環(huán)境（20°C，厭氧）中添加諾氟沙星（0–100 μg/L）（方法2.1-2.2）。

 

監(jiān)測指標(biāo)：

 

氮轉(zhuǎn)化動力學(xué)：NO??、NO??、NO、N?O濃度（圖2）。

 

生理響應(yīng)：細(xì)菌生長（OD???）、碳源（乙酸鈉）消耗、ETSA（圖1, 3）。

 

酶與基因：動態(tài)NAR/NIR活性（圖4）、反硝化功能基因（narG, napA, nirS, nirK, norB, nosZ）表達(dá)（圖5）。

 

2. 關(guān)鍵技術(shù)

 

動態(tài)酶活監(jiān)測：每12小時取樣，測定NAR/NIR活性（單位：nmol NO??-N mg?1 protein min?1）（方法2.4）。

 

Unisense電極：原位檢測水-氣兩相NO/N?O濃度，結(jié)合亨利定律計算總排放量（方法2.6）。

 

3. 數(shù)據(jù)分析

 

敏感性評估：通過酶活變化幅度（圖4陰影面積）量化NAR/NIR對諾氟沙星的敏感性差異。

 

統(tǒng)計驗證：ANOVA分析差異顯著性（p<0.05）（方法2.7）。

 

四、關(guān)鍵數(shù)據(jù)及研究意義

1. 細(xì)菌生長抑制（圖1a, b）

 

數(shù)據(jù)來源：S-Gompertz模型擬合生長曲線，計算最大比生長速率（μm）。

 

結(jié)果：100 μg/L諾氟沙星使μm從0.083 h?1降至0.055 h?1（r = -0.95）。

 

意義：證實諾氟沙星直接損害反硝化菌增殖能力，為反硝化效率下降提供生理學(xué)依據(jù)。

 

2. 氮轉(zhuǎn)化異常（圖2）

 

數(shù)據(jù)來源：NO??/NO??光譜法、NO/N?O電極監(jiān)測。

 

結(jié)果：

 

NO??半衰期從4.77 h（對照）延長至14.71 h（100 μg/L）。

 

N?O排放峰值增加177倍。

 

意義：揭示諾氟沙星加劇地下水系統(tǒng)溫室氣體排放風(fēng)險，為氮循環(huán)模型修正提供數(shù)據(jù)支撐。

 

3. 碳代謝與電子傳遞抑制（圖3）

 

數(shù)據(jù)來源：乙酸鈉消耗量、ETSA（INT還原法）。

 

結(jié)果：100 μg/L諾氟沙星使碳源利用降低35.1%，ETSA降低43.3%。

 

意義：闡明抗生素通過限制能量（電子）供應(yīng)間接抑制反硝化，深化對代謝干擾機(jī)制的理解。

 

4. 酶活動態(tài)響應(yīng)（圖4）

 

數(shù)據(jù)來源：動態(tài)監(jiān)測NAR/NIR活性（分光光度法）。

 

結(jié)果：

 

NAR活性持續(xù)受抑（陰影面積擴(kuò)大4倍）。

 

NIR活性后期增強(qiáng)，導(dǎo)致NO??積累減少。

 

意義：首次通過實時酶活數(shù)據(jù)揭示抗生素對反硝化酶的差異調(diào)控，解釋氮中間產(chǎn)物的非平衡轉(zhuǎn)化。

 

5. 基因表達(dá)調(diào)控（圖5）

 

數(shù)據(jù)來源：qPCR定量反硝化功能基因。

 

結(jié)果：100 μg/L諾氟沙星使narG表達(dá)下調(diào)62.3%，norB上調(diào)93.4%，norB/nosZ比率升高至93.41（對照為0.05）。

 

意義：從分子水平證實N?O排放增加源于還原酶基因（nosZ）表達(dá)受阻，為抗生素生態(tài)毒性提供遺傳證據(jù)。

 

五、結(jié)論

 

劑量依賴性抑制：諾氟沙星≥10 μg/L顯著抑制反硝化菌生長（OD???↓）和NO??還原（半衰期↑）。

 

N?O排放風(fēng)險：100 μg/L諾氟沙星使N?O排放增加177倍，主要源于norB基因上調(diào)和nosZ基因下調(diào)。

 

酶活差異調(diào)控：NAR對諾氟沙星更敏感（抑制率＞NIR），動態(tài)酶活監(jiān)測揭示其通過抑制NAR主導(dǎo)NO??還原受阻。

 

地下水修復(fù)啟示：抗生素污染需關(guān)注反硝化酶活動態(tài)變化，優(yōu)化修復(fù)策略以降低N?O排放。

 

六、丹麥Unisense電極數(shù)據(jù)的深度解讀

1. 技術(shù)原理與實驗設(shè)計

 

測量指標(biāo)：水相與氣相中NO、N?O濃度（方法2.6）。

 

設(shè)備參數(shù)：Unisense微傳感器連接8通道剖面測量系統(tǒng)，檢測限＜1 μg/L。

 

數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換：亨利定律（Hcc = Ca/Cg）計算氣相濃度（NO: Hcc=0.05, N?O: Hcc=0.69, 20°C）。

 

2. 關(guān)鍵結(jié)果

 

N?O動態(tài)監(jiān)測（圖2d）：

 

對照：N?O-N＜120 μg/L，無顯著積累。

 

100 μg/L諾氟沙星：N?O-N峰值達(dá)120 μg/L（96 h），總排放量（Ct）顯著升高（公式2）。

 

排放比計算（公式3）：EN?O = CN?O / (CNO + CN?O)，諾氟沙星組EN?O升高177倍。

 

3. 研究意義

 

原位高精度監(jiān)測：避免取樣擾動，精準(zhǔn)捕獲瞬態(tài)氣體釋放（如暗/光切換響應(yīng)）。

 

量化N?O排放通量：結(jié)合亨利定律，首次量化地下水反硝化過程中抗生素誘導(dǎo)的N?O氣-液分配，為全球溫室氣體預(yù)算模型提供地下水源數(shù)據(jù)。

 

機(jī)制關(guān)聯(lián)：電極數(shù)據(jù)驗證高norB/nosZ基因比導(dǎo)致N?O還原受阻，銜接分子機(jī)制與表觀排放。

 

4. 環(huán)境應(yīng)用價值

 

風(fēng)險評估：為抗生素污染地下水區(qū)的N?O“熱點”識別提供技術(shù)支撐。

 

修復(fù)優(yōu)化：指導(dǎo)反硝化生物強(qiáng)化中菌劑篩選（優(yōu)先選育nosZ高表達(dá)菌株）。

 

總結(jié)

 

本研究通過Unisense電極等多維技術(shù)證實：諾氟沙星通過抑制NAR活性和上調(diào)norB基因，導(dǎo)致地下水反硝化受阻并加劇N?O排放。動態(tài)酶活監(jiān)測揭示NAR對諾氟沙星的敏感性高于NIR，為抗生素污染場地的氮循環(huán)調(diào)控提供新視角。