Insights into the Production and Role of Nitric Oxide in the Antarctic Sea-ice Diatom Fragilariopsis cylindrus

南極海冰硅藻柱狀脆桿藻中一氧化氮的產(chǎn)生及作用研究  

來源：Journal of Phycology，Volume56, Issue5，October 2020，Pages 1196-1207

《藻類學(xué)雜志》，第56卷，第5期，2020年10月，第1196-1207頁

 

 

摘要  

摘要闡述了南極海冰硅藻柱狀脆桿藻(Fragilariopsis cylindrus)中一氧化氮(NO)的產(chǎn)生機制及其生理作用。通過微傳感器、微流體室和人工海冰槽等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)NO的產(chǎn)生依賴于亞硝酸鹽(NO??)并通過硝酸還原酶(NR)途徑。光照會抑制NO產(chǎn)生，但當(dāng)光合電子傳遞受阻(如添加抑制劑DCMU)時，光照下仍可誘導(dǎo)NO生成。外源NO會抑制藻細胞生長、破壞光合作用并改變非光化學(xué)淬滅機制。環(huán)境脅迫(鹽度、溫度變化)也會觸發(fā)NO產(chǎn)生，表明NO可能作為"脅迫信號"分子參與細胞響應(yīng)。  

 

研究目的  

1.  確定柱狀脆桿藻中NO產(chǎn)生的主要酶促途徑。  

2.  探究海冰相關(guān)非生物因素(如溫度、鹽度)是否影響NO產(chǎn)生。  

3.  評估外源NO對藻細胞光生理學(xué)的影響。  

 

研究思路  

1.  核心方法： 使用微流體室結(jié)合丹麥Unisense公司生產(chǎn)的Clarke型NO微電極(NO-100μm)，在精確控制的微環(huán)境中實時原位監(jiān)測細胞尺度上的NO動態(tài)變化。  

2.  生化途徑驗證： 在微流體室中向細胞施加不同氮源(亞硝酸鹽、硝酸鹽、L-精氨酸)及特定抑制劑(如NOS阻斷劑L-NAME、NO清除劑血紅蛋白Hb)，通過電極信號變化判斷NO來源途徑。  

3.  光調(diào)控研究： 在微流體室中精確控制光照條件(黑暗、低光、高光)，并結(jié)合光合抑制劑DCMU處理，研究光照及光合電子傳遞對NO產(chǎn)生的影響。  

4.  環(huán)境脅迫模擬： 使用溫度梯度裝置和鹽度調(diào)節(jié)培養(yǎng)液，測量不同溫度(-1.7°C至7.7°C)和鹽度(36至55)脅迫下細胞內(nèi)的NO產(chǎn)量(同樣使用Unisense電極在黑暗條件下測量)。  

5.  外源NO效應(yīng)： 使用NO供體SNAP處理藻細胞，利用調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(Water-PAM)測量其對光合效率(Fv/Fm)、相對電子傳遞速率(rETRmax)、光化學(xué)淬滅(qP)及非光化學(xué)能量耗散組分(ΦII, ΦNPQ, ΦNO)的影響，并檢測其對細胞生長和ATP含量的影響。  

6.  生態(tài)關(guān)聯(lián)驗證： 在人工倒置海冰槽中模擬海冰環(huán)境，嵌入培養(yǎng)柱進行平行實驗，比較與實驗室微流體結(jié)果的差異。  

 

測量的數(shù)據(jù)及研究意義  

1.  NO產(chǎn)生速率 (圖2, 圖3, 圖4, 圖5, 圖6, 圖7)： 使用Unisense電極測量。意義： 直接量化不同處理(氮源、光照、抑制劑、溫度、鹽度)下細胞產(chǎn)生的NO量，是確定產(chǎn)生途徑和環(huán)境響應(yīng)的核心證據(jù)。圖2/圖3證明亞硝酸鹽依賴的NR途徑是主要來源；圖4/圖5/圖6證明光抑制及其與光合電子鏈的關(guān)聯(lián)；圖7證明溫鹽脅迫的誘導(dǎo)作用。  

 

 

 

 

 

 

2.  光合參數(shù)：  

    ?   Fv/Fm (最大量子產(chǎn)量，圖7A, 圖8A)： 反映PSII最大光化學(xué)效率。意義： 指示光合機構(gòu)整體健康狀況，溫鹽脅迫(圖7A)和外源NO(圖8A)均顯著降低Fv/Fm，表明脅迫損傷。  

 

    ?   rETRmax (最大相對電子傳遞速率，圖8B)： 反映PSII到PSI的電子傳遞鏈最大能力。意義： 外源NO顯著抑制rETRmax(圖8B)，表明NO干擾了光合電子傳遞。  

 

    ?   qP (光化學(xué)淬滅，圖9A)： 反映PSII反應(yīng)中心開放程度(QA氧化態(tài))。意義： 外源NO顯著降低qP(圖9A)，表明NO導(dǎo)致反應(yīng)中心“關(guān)閉”，阻礙電子從QA向QB傳遞。  

 

    ?   能量分配組分 (ΦII, ΦNPQ, ΦNO, 圖9B)： 分別代表用于光化學(xué)轉(zhuǎn)化的能量、通過調(diào)節(jié)機制耗散的能量、非調(diào)節(jié)性耗散的能量。意義： 外源NO降低ΦNPQ而增加ΦNO(圖9B)，表明NO破壞了依賴類胡蘿卜素/葉黃素循環(huán)的調(diào)節(jié)性能量耗散機制，導(dǎo)致更多能量以非調(diào)節(jié)性方式(可能造成損傷)耗散。  

 

3.  生長數(shù)據(jù) (細胞濃度，圖8C)： 意義： 外源NO顯著抑制藻細胞生長(圖8C)，證明其對細胞增殖有毒性。  

4.  ATP含量 (圖8D)： 意義： 高濃度外源NO(10mM SNAP)導(dǎo)致細胞ATP含量下降(圖8D)，但下降程度小于光合抑制程度，提示可能存在補償機制或測量靈敏度限制。  

 

結(jié)論  

1.  產(chǎn)生機制： 柱狀脆桿藻的NO產(chǎn)生主要依賴亞硝酸鹽(NO??)途徑，由硝酸還原酶(NR) 催化。未檢測到L-精氨酸-NOS途徑的證據(jù)。光照通過維持活躍的光合電子流(促進亞硝酸鹽同化)抑制NO產(chǎn)生。光合電子傳遞受阻(如黑暗、DCMU處理、高光脅迫)導(dǎo)致亞硝酸鹽積累并觸發(fā)NR介導(dǎo)的NO產(chǎn)生。  

2.  環(huán)境響應(yīng)： 溫度升高(>0°C，尤其是7.7°C)和高鹽脅迫(>38)均可誘導(dǎo)NO產(chǎn)生，同時伴隨光合效率(Fv/Fm)下降，表明NO產(chǎn)生與環(huán)境脅迫密切相關(guān)。藻源醛類(DD)也能強烈誘導(dǎo)NO產(chǎn)生。  

3.  生理作用： 高濃度的外源NO具有負面生理效應(yīng)：抑制細胞生長、抑制PSII最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和電子傳遞速率(rETRmax)、導(dǎo)致PSII反應(yīng)中心關(guān)閉(qP下降)、擾亂調(diào)節(jié)性能量耗散機制(ΦNPQ下降，ΦNO上升)、降低細胞ATP水平。在脅迫條件下產(chǎn)生的內(nèi)源NO可能作為“脅迫信號”分子參與細胞生理調(diào)節(jié)或程序性死亡信號通路。  

 

使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義  

使用丹麥Unisense公司生產(chǎn)的NO-100μm Clarke型微電極進行測量，其研究意義至關(guān)重要且獨特：  

1.  實時原位高分辨率監(jiān)測： 該電極允許在微米尺度上（距離細胞約50-100μm），對活體細胞在其生長的微環(huán)境（微流體室、海冰槽模擬環(huán)境）中進行實時、連續(xù)的NO濃度變化監(jiān)測（如圖3、圖4、圖5、圖6）。這種原位監(jiān)測能力避免了傳統(tǒng)方法（如化學(xué)檢測培養(yǎng)上清液）可能帶來的樣本破壞、時間滯后和空間分辨率低的問題。  

2.  驗證生化途徑的核心工具： 通過精確添加底物（如NO??）和特異性抑制劑/清除劑（如Hb），并結(jié)合電極信號的即時、顯著變化（如圖3：添加Hb后NO信號被快速淬滅；圖2：添加NO??后信號顯著升高），該技術(shù)為確定NO產(chǎn)生的主要生化途徑（亞硝酸鹽-NR途徑） 和排除其他途徑（精氨酸-NOS途徑） 提供了最直接、有力的電化學(xué)證據(jù)。其高靈敏度能可靠檢測到低至pA級別的電流變化（如圖4, 圖5）。  

3.  揭示光調(diào)控動態(tài)的關(guān)鍵： 微電極能夠捕捉NO產(chǎn)生對光照狀態(tài)轉(zhuǎn)換的快速響應(yīng)（如圖4：光照開始后NO信號迅速下降）。結(jié)合光照條件的精確控制和光合抑制劑的使用（如圖6），它清晰地證明了光合電子流狀態(tài)對NO產(chǎn)生的動態(tài)開關(guān)作用（光照抑制，電子傳遞受阻則誘導(dǎo)）。這在批量培養(yǎng)的化學(xué)檢測中難以實現(xiàn)如此精確的時序關(guān)聯(lián)。  

4.  量化環(huán)境脅迫響應(yīng)： 在模擬環(huán)境脅迫（溫度梯度、鹽度變化）實驗中（圖7），微電極能夠高靈敏度地量化不同脅迫程度下細胞產(chǎn)生的NO量。這種定量關(guān)系（如溫度升高/鹽度增加與NO產(chǎn)量上升）是建立NO作為脅迫生物標志物或信號分子假設(shè)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。  

5.  驗證生態(tài)相關(guān)性： 通過在海冰槽模擬環(huán)境中（圖6B）使用同款電極進行測量，雖然產(chǎn)量較低，但觀察到了與微流體室實驗一致的NO產(chǎn)生模式（如對NO??和DCMU的響應(yīng)）。這提示實驗室微環(huán)境結(jié)果具有生態(tài)意義，同時微電極也揭示了不同環(huán)境（開放式vs封閉式）可能影響NO累積水平。  

6.  高特異性與可靠性： 使用NO清除劑血紅蛋白(Hb)可特異性淬滅電極檢測到的信號（如圖3, 圖5），這強有力地證明了所測信號確實源于NO本身，而非其他可能的電化學(xué)干擾物質(zhì)，確保了數(shù)據(jù)的可靠性和特異性。  

 

綜上所述，丹麥Unisense NO微電極是該研究不可或缺的核心技術(shù)平臺，其高時空分辨率、特異性、靈敏度和原位監(jiān)測能力，使得研究者能夠首次在細胞微環(huán)境水平上清晰地描繪出南極硅藻柱狀脆桿藻NO產(chǎn)生的生化途徑、調(diào)控機制及其對環(huán)境脅迫的響應(yīng)動態(tài)。