Impacts of chlorothalonil on denitrification and N2O emission in riparian sediments: Microbial metabolism mechanism

百菌清對(duì)河岸沉積物反硝化和N2O排放的影響微生物代謝機(jī)制

來(lái)源：Water Research 148 (2019) 188e197

 

論文摘要

本研究揭示了常用殺菌劑氯硝胺（CTN）在河岸帶沉積物中的積累對(duì)氮循環(huán)的負(fù)面影響。研究發(fā)現(xiàn)，CTN會(huì)抑制反硝化作用，導(dǎo)致硝酸鹽（NO??）在沉積物中積累，同時(shí)顯著增加溫室氣體N2O的排放（增幅達(dá)208-377%）。機(jī)制研究表明，CTN主要通過(guò)抑制反硝化微生物的代謝活性（特別是甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH的活性）和N2O還原酶（NOS）的活性來(lái)發(fā)揮作用，而非通過(guò)影響功能基因（如nosZ）的豐度。這表明，CTN污染會(huì)通過(guò)干擾微生物的電子生產(chǎn)、傳輸和消耗過(guò)程，破壞河岸帶的脫氮功能。

 

研究目的

本研究的主要目的是：

 

探究CTN積累對(duì)河岸帶沉積物健康和微生物活性的影響。

明確CTN對(duì)河岸帶反硝化過(guò)程及其最終產(chǎn)物N2O排放的具體影響。

從微生物代謝機(jī)制層面（包括電子產(chǎn)生、傳輸和消耗）揭示CTN影響反硝化作用的深層原理。

 

建立反硝化酶活性與反硝化速率之間的預(yù)測(cè)模型，識(shí)別關(guān)鍵控制因子。

 

研究思路

本研究采用了 “野外調(diào)查”與“室內(nèi)控制實(shí)驗(yàn)”相結(jié)合的系統(tǒng)研究思路：

 

野外調(diào)查：在三峽水庫(kù)庫(kù)區(qū)的河岸帶采集水和沉積物樣本，了解環(huán)境背景值，包括CTN的本底濃度。

室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)：

 

40天培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：將沉積物暴露于三個(gè)濃度的CTN（5, 10, 25 mg kg?1）下，模擬CTN在河岸帶的長(zhǎng)期積累效應(yīng)。

 

60小時(shí)厭氧暴露實(shí)驗(yàn)：在上述培養(yǎng)結(jié)束后，立即進(jìn)行短期的厭氧培養(yǎng)，并添加統(tǒng)一的碳源（葡萄糖）和氮源（硝酸鹽），以精確監(jiān)測(cè)CTN對(duì)反硝化過(guò)程動(dòng)態(tài)的影響。在此實(shí)驗(yàn)中，采用了破壞性采樣策略，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)量各種參數(shù)。

 

測(cè)量數(shù)據(jù)及其研究意義（注明來(lái)源）

本研究測(cè)量了多方面的數(shù)據(jù)，其意義和來(lái)源如下：

 

CTN殘留濃度：

 

意義：確認(rèn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的有效性，明確不同處理組暴露的實(shí)際濃度，為劑量-效應(yīng)關(guān)系分析提供基礎(chǔ)。

 

來(lái)源：數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

 

沉積物健康指標(biāo)（微生物呼吸速率）：

 

意義：反映沉積物中微生物的整體活性。基礎(chǔ)呼吸速率代表原位微生物活性，底物誘導(dǎo)呼吸速率代表微生物的潛在活性。結(jié)果表明高濃度CTN對(duì)微生物群落產(chǎn)生了毒性壓力。

 

來(lái)源：圖1顯示了基礎(chǔ)呼吸和底物誘導(dǎo)呼吸速率。

 

氮轉(zhuǎn)化與反硝化速率：

 

意義：直接證明CTN對(duì)反硝化功能的抑制（NO??和NO??積累，反硝化速率降低）和對(duì)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的加劇（N2O排放顯著增加）。這是本研究最核心的發(fā)現(xiàn)。

 

來(lái)源：NO??、NO??濃度動(dòng)態(tài)和N2O積累量見(jiàn)圖2a和2b；基于1?N同位素配對(duì)技術(shù)測(cè)量的反硝化速率見(jiàn)圖2c。

 

微生物代謝關(guān)鍵參數(shù)：

 

意義：從機(jī)理上解釋反硝化作用被抑制的源頭。研究發(fā)現(xiàn)CTN特異性抑制了糖酵解途徑中GAPDH催化的關(guān)鍵步驟，導(dǎo)致電子供體（NADH）和能量（ATP）減少，從而限制了整個(gè)反硝化過(guò)程的電子供應(yīng)。

 

來(lái)源：代謝通路示意圖見(jiàn)圖3a；葡萄糖激酶（GK）和GAPDH活性數(shù)據(jù)見(jiàn)圖3b和3c；NADH和ATP含量見(jiàn)圖3d和3e。

 

電子傳輸系統(tǒng)（ETS）活性和反硝化酶活性：

 

意義：揭示了電子傳輸和消耗環(huán)節(jié)如何被CTN破壞。ETS活性下降表明電子傳輸效率降低；四種關(guān)鍵反硝化酶（NAR, NIR, NOR, NOS）中，NOS活性受到最顯著的抑制，這直接解釋了為何N2O不能進(jìn)一步被還原為N2，導(dǎo)致排放增加。

 

來(lái)源：電子傳遞鏈?zhǔn)疽鈭D見(jiàn)圖4a；四種反硝化酶活性數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4b-e；ETS活性見(jiàn)圖4f。

 

功能基因豐度和微生物群落結(jié)構(gòu)：

 

意義：通過(guò)對(duì)比基因水平（DNA） 和酶活性水平（功能表達(dá)） 的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)CTN影響的是基因的表達(dá)或酶蛋白的功能，而非基因的存在與否。這強(qiáng)調(diào)了在評(píng)估污染物影響時(shí)，僅測(cè)量基因豐度可能不夠，必須關(guān)注實(shí)際的酶活性。群落結(jié)構(gòu)變化表明CTN對(duì)特定反硝化菌屬（如假單胞菌屬）有抑制作用。

 

來(lái)源：功能基因豐度見(jiàn)圖4g；微生物群落結(jié)構(gòu)（門(mén)和屬水平）見(jiàn)圖5a和5b。

 

研究結(jié)論

 

主要影響：CTN積累（≥10 mg kg?1）會(huì)顯著抑制河岸帶沉積物的反硝化作用，導(dǎo)致硝酸鹽積累，并大幅促進(jìn)強(qiáng)效溫室氣體N2O的排放。

核心機(jī)制：CTN通過(guò)干擾反硝化微生物的代謝過(guò)程來(lái)抑制反硝化作用。具體途徑為：抑制糖酵解中的GAPDH活性 → 減少電子供體NADH的產(chǎn)生 → 削弱電子傳輸系統(tǒng)（ETS） 效率 → 特別是抑制了末端反硝化酶N2O還原酶（NOS） 的活性，阻止N2O被還原為N2。

關(guān)鍵因子：NOS酶活性（而非nosZ基因豐度）是調(diào)控N2O排放和預(yù)測(cè)反硝化速率的關(guān)鍵因子（結(jié)構(gòu)方程模型結(jié)果見(jiàn)圖7）。

 

環(huán)境意義：河岸帶中農(nóng)藥的廣泛存在可能通過(guò)上述機(jī)制削弱其凈化硝酸鹽污染的能力，并增加其對(duì)氣候變化的貢獻(xiàn)，因此需要控制農(nóng)藥面源污染。

 

使用丹麥Unisense電極測(cè)量數(shù)據(jù)的研究意義詳細(xì)解讀

在本文中，丹麥Unisense公司的技術(shù)被應(yīng)用于兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：

 

測(cè)量反硝化酶（NOR和NOS）活性：在方法部分（2.4節(jié)）提到，在測(cè)定一氧化氮還原酶（NOR）和N2O還原酶（NOS）的活性時(shí)，反應(yīng)中產(chǎn)生或消耗的N2O濃度是使用Unisense的微傳感器檢測(cè)的。

 

監(jiān)測(cè)厭氧實(shí)驗(yàn)中的溶解氧（DO）：在好氧-厭氧培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中（2.3節(jié)及圖S4提及），使用Unisense的微電極來(lái)監(jiān)測(cè)沉積物柱中溶解氧（DO）的動(dòng)態(tài)變化。

 

詳細(xì)研究意義如下：

 

實(shí)現(xiàn)高精度、原位、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：Unisense微電極以其高空間分辨率（可達(dá)微米級(jí)）和時(shí)間分辨率而聞名。在測(cè)量酶活性時(shí)，它可以實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)溶液中N2O濃度的微小變化，從而精確計(jì)算出NOR和NOS的酶活性。這種精度是傳統(tǒng)離線采樣方法難以比擬的。

確保酶活性測(cè)定的準(zhǔn)確性：反硝化酶對(duì)氧氣高度敏感。在測(cè)定過(guò)程中，保持嚴(yán)格的厭氧環(huán)境至關(guān)重要。使用Unisense微電極可以實(shí)時(shí)確認(rèn)反應(yīng)體系是否處于所需的厭氧狀態(tài)，避免了因氧氣泄漏導(dǎo)致的酶活性測(cè)量誤差，保證了數(shù)據(jù)的可靠性。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定性：在長(zhǎng)期的厭氧暴露實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)Unisense溶解氧微電極持續(xù)監(jiān)測(cè)DO濃度，研究人員可以確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沉積物核心始終處于穩(wěn)定的厭氧條件。這為觀察到的反硝化動(dòng)態(tài)變化（如NO??減少和N2O積累）是由CTN而非氧氣波動(dòng)引起的提供了強(qiáng)有力的證據(jù)支持。

 

支撐機(jī)制研究的深度：正是憑借Unisense電極提供的精確酶活性數(shù)據(jù)，本研究才能令人信服地得出結(jié)論：CTN對(duì)N2O排放的促進(jìn)作用主要是通過(guò)抑制NOS酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而不是通過(guò)影響編碼該酶的nosZ基因的豐度。這一發(fā)現(xiàn)將機(jī)理研究從“基因存在”層面提升到了“功能表達(dá)”層面，極大地增強(qiáng)了研究的深度和說(shuō)服力。

 

綜上所述，使用丹麥Unisense電極的技術(shù)為本研究提供了關(guān)鍵、可靠的高精度數(shù)據(jù)，特別是在酶活性和環(huán)境因子實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方面，為揭示CTN影響反硝化作用的微觀機(jī)理提供了不可或缺的技術(shù)支撐。