Heterogeneity in respiratory electron transfer and adaptive iron utilization in a bacterial biofilm

細(xì)菌生物膜中呼吸電子轉(zhuǎn)移的異質(zhì)性和鐵的適應(yīng)性利用

來源：Nature Communications 2019年，第10卷，文章編號(hào)3702

論文總結(jié)

研究通過多學(xué)科方法探究了枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）生物膜形成過程中鐵離子的獨(dú)特利用策略，揭示了細(xì)胞內(nèi)外電子傳遞的異質(zhì)性及其對(duì)生物膜發(fā)育的關(guān)鍵作用。以下是對(duì)論文的詳細(xì)總結(jié)。

 

摘要概括

摘要指出，枯草芽孢桿菌的 robust 生物膜形成需要大量鐵離子（Fe3?）。研究發(fā)現(xiàn)，這一過程依賴于優(yōu)先產(chǎn)生鐵載體前體2,3-二羥基苯甲酸（DHB），而非完整鐵載體 bacillibactin。大部分鐵與生物膜基質(zhì) extracellularly 結(jié)合，生物膜表現(xiàn)出導(dǎo)電性，細(xì)胞外鐵可能作為電子受體。較少比例的Fe3?被內(nèi)化，用于增強(qiáng)含鐵酶（如呼吸鏈酶）的生產(chǎn)，從而建立強(qiáng)膜電位，促進(jìn)生物膜基質(zhì)合成。研究強(qiáng)調(diào)了枯草芽孢桿菌生物膜內(nèi)的代謝多樣性和適應(yīng)性能量生成策略。

研究目的

本研究旨在解決以下核心問題：

 

探究為什么枯草芽孢桿菌生物膜形成需要異常高量的鐵（數(shù)百倍于生長需求）。

揭示鐵在生物膜中的具體作用機(jī)制，包括吸收、利用和其在電子傳遞中的角色。

 

闡明生物膜內(nèi)細(xì)胞間代謝異質(zhì)性，特別是氧限制區(qū)域細(xì)胞的能量代謝策略。

 

研究思路

研究采用多層次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

 

遺傳學(xué)方法：構(gòu)建枯草芽孢桿菌突變體（如dhbA-F操作子突變體），評(píng)估生物膜表型，并通過化學(xué)補(bǔ)充（如DHB）驗(yàn)證關(guān)鍵分子作用。

分子生物學(xué)技術(shù)：使用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）分析基因表達(dá)；β-半乳糖苷酶報(bào)告系統(tǒng)檢測啟動(dòng)子活性。

生化分析：采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）測量細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外鐵濃度；循環(huán)伏安法（CV）評(píng)估生物膜導(dǎo)電性和電子傳遞能力。

微生物學(xué)技術(shù)：使用熒光染料（如硫黃素T, ThT）測量膜電位；丹麥Unisense微電極系統(tǒng)測量氧濃度和氧化還原電位剖面。

 

數(shù)據(jù)整合：結(jié)合遺傳、生化和電化學(xué)數(shù)據(jù)，構(gòu)建模型解釋鐵在生物膜中的雙重角色。

 

測量數(shù)據(jù)及其研究意義

以下列出關(guān)鍵測量數(shù)據(jù)、其來源（圖或表編號(hào)）及研究意義：

 

生物膜表型數(shù)據(jù)（來源：Fig. 1）

 

數(shù)據(jù)：dhbA、dhbB、dhbC突變體顯示嚴(yán)重生物膜缺陷，而dhbE和dhbF突變體表型正常；補(bǔ)充DHB（1 μg/mL）能挽救突變體表型。

 

研究意義：表明DHB（而非bacillibactin）是生物膜形成的關(guān)鍵，揭示了鐵載體前體的適應(yīng)性優(yōu)勢。

 

基因表達(dá)數(shù)據(jù)（來源：Fig. 2）

 

數(shù)據(jù)：RT-qPCR顯示dhbA、dhbB、dhbC、dhbE在生物膜中高表達(dá)，但dhbF表達(dá)低于檢測限；β-半乳糖苷酶活性證實(shí)AbrB和Fur共同調(diào)控dhb操作子。

 

研究意義：揭示了dhb操作子的差異表達(dá)，支持DHB優(yōu)先生產(chǎn)的調(diào)控機(jī)制，適應(yīng)高鐵環(huán)境。

 

代謝酶突變體數(shù)據(jù)（來源：Fig. 3）

 

數(shù)據(jù)：ΔsdhC、ΔmenH、ΔgpsA突變體生物膜缺陷；RT-qPCR顯示高鐵條件（50 μM FeCl?）下電子傳遞鏈基因（sdhC、ndhF、gpsA等）表達(dá)上調(diào)；抑制劑TTFA（50-100 μM）抑制生物膜形成。

 

研究意義：表明含鐵呼吸酶對(duì)生物膜至關(guān)重要，鐵通過增強(qiáng)電子傳遞鏈功能促進(jìn)膜電位建立。

 

膜電位數(shù)據(jù)（來源：Fig. 4）

 

數(shù)據(jù)：ThT熒光顯示ΔsdhC突變體膜電位低；野生型生物膜外圍細(xì)胞膜電位高，與基質(zhì)基因表達(dá)正相關(guān)。

 

研究意義：直接 linking 膜電位與基質(zhì)生產(chǎn)，呼吸電子傳遞是膜電位建立的關(guān)鍵。

 

鐵分布數(shù)據(jù)（來源：Fig. 5）

 

數(shù)據(jù)：ICP-MS顯示細(xì)胞內(nèi)鐵濃度變化小（<1倍），但細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)鐵濃度高（10倍于細(xì)胞內(nèi)）；氧微電極顯示生物膜深度增加氧濃度降低；氧化還原微電極顯示底部還原性增強(qiáng)。

 

研究意義：揭示鐵主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，可能作為電子受體；生物膜內(nèi)氧梯度導(dǎo)致代謝異質(zhì)性。

 

電化學(xué)數(shù)據(jù)（來源：Fig. 6）

 

數(shù)據(jù)：循環(huán)伏安法顯示生物膜涂層電極能還原Fe3?（ redox peaks at -40/-170 mV），而對(duì)照無此現(xiàn)象。

 

研究意義：證明生物膜具有細(xì)胞外電子傳遞（EET）能力，鐵作為電子受體。

 

補(bǔ)充數(shù)據(jù)（來源：Supplementary Figures）

 

數(shù)據(jù)：生長曲線顯示鐵濃度對(duì)生長影響小；酶活性數(shù)據(jù)等。

 

研究意義：支持主要結(jié)論，排除生長抑制作為生物膜缺陷的原因。

 

研究結(jié)論

本研究得出以下核心結(jié)論：

 

DHB的適應(yīng)性優(yōu)勢：枯草芽孢桿菌在生物膜條件下優(yōu)先生產(chǎn)DHB而非bacillibactin，以更高效地 solubilize 和利用鐵。

鐵的雙重角色：內(nèi)化鐵增強(qiáng)呼吸酶活性和膜電位，促進(jìn)基質(zhì)生產(chǎn)；細(xì)胞外鐵作為電子受體支持EET，尤其在氧限制區(qū)域。

代謝異質(zhì)性：生物膜頂部細(xì)胞依賴氧進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)電子傳遞（IET），底部細(xì)胞利用EET維持能量代謝，體現(xiàn)了呼吸策略的多樣性。

 

調(diào)控機(jī)制：AbrB和Fur共同調(diào)控dhb操作子，響應(yīng)生物膜信號(hào)和鐵可用性。

 

丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的詳細(xì)解讀

在本研究中，丹麥Unisense微電極系統(tǒng)用于原位測量生物膜內(nèi)的氧濃度和氧化還原電位剖面，其研究意義主要體現(xiàn)在：

 

高分辨率原位測量：Unisense氧微電極（型號(hào)OX-50，尖端直徑50 μm）和氧化還原微電極（型號(hào)RD-500）提供微米級(jí)空間分辨率（步長10-50 μm），能夠?qū)崟r(shí)、無擾動(dòng)地測量生物膜微環(huán)境中的氧動(dòng)力學(xué)和氧化還原狀態(tài)（Fig. 5c, d）。這避免了傳統(tǒng)取樣方法可能引入的擾動(dòng)，確保了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。

揭示生物膜異質(zhì)性：氧剖面數(shù)據(jù)（Fig. 5c）顯示，從生物膜頂部到底部，氧濃度逐漸降低（在 outer region 從~200 μM降至接近0），表明生物膜內(nèi)部存在顯著氧梯度。這直接證明了頂部細(xì)胞好氧、底部細(xì)胞缺氧的微環(huán)境差異，為代謝異質(zhì)性提供了直接證據(jù)。氧化還原剖面數(shù)據(jù)（Fig. 5d）顯示，pellicle biofilm 底部氧化還原電位降低（還原性增強(qiáng)），表明缺氧區(qū)域可能發(fā)生還原反應(yīng)，如Fe3?還原。

支持EET機(jī)制：氧化還原數(shù)據(jù)與電化學(xué)數(shù)據(jù)（Fig. 6）結(jié)合，表明底部細(xì)胞可能利用細(xì)胞外鐵作為電子受體進(jìn)行厭氧呼吸（EET），從而維持膜電位和能量生產(chǎn)。這解釋了為什么生物膜底部細(xì)胞在缺氧條件下仍能保持活力（如 live/dead 染色所示）。

 

技術(shù)優(yōu)勢與貢獻(xiàn)：Unisense系統(tǒng)的實(shí)時(shí)和高精度測量能力，使其成為研究生物膜微環(huán)境的黃金標(biāo)準(zhǔn)。這些數(shù)據(jù)直接支撐了研究的核心模型——生物膜內(nèi)IET和EET的共存，強(qiáng)調(diào)了鐵在跨尺度電子傳遞中的關(guān)鍵作用。沒有這些原位測量，生物膜異質(zhì)性和EET假設(shè)將缺乏實(shí)證基礎(chǔ)。

 

總之，丹麥Unisense電極數(shù)據(jù)是本研究的基石，通過提供精確的微環(huán)境剖面，它直接揭示了生物膜內(nèi)的氧和氧化還原梯度，為理解鐵適應(yīng)性利用和電子傳遞異質(zhì)性提供了關(guān)鍵證據(jù)。這項(xiàng)技術(shù)突出了原位測量在微生物生態(tài)研究中的不可替代價(jià)值。