Two uptake hydrogenases differentially interact with the aerobic respiratory chain during mycobacterial growth and persistence

分枝桿菌生長和持續(xù)過程中，兩種攝取氫化酶與有氧呼吸鏈的相互作用不同

來源：Journal of Biological Chemistry（2019年，第294卷，第50期）

 

論文總結(jié)

研究通過綜合運用遺傳學、生物化學和生理學方法，探究了恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）中兩種高親和力[NiFe]氫酶（Huc和Hhy）在生長和持久期的差異表達、定位及與好氧呼吸鏈的整合機制。以下是對論文的詳細總結(jié)。

摘要概括

摘要指出，好氧土壤細菌通過氧化大氣氫氣（H?）支持其在營養(yǎng)限制環(huán)境中的生存，這是全球H?循環(huán)的主要匯。M. smegmatis 編碼兩種[NiFe]氫酶（Huc和Hhy），它們均能氧化H?至亞大氣濃度，并增強細菌在缺氧和碳限制下的生存能力。但為何需要兩種功能相似的氫酶？本研究證實，Huc和Hhy差異表達、定位和整合到呼吸鏈中：Huc在指數(shù)后期和靜止早期活躍，支持混合營養(yǎng)生長和向休眠過渡的能量守恒；Hhy在長期持久期活躍，提供碳耗盡后的維持能量。兩者通過menaquinone池與好氧呼吸鏈 obligately 連接，但差異受呼吸解偶聯(lián)劑影響。Huc專門捐贈電子給質(zhì)子泵 cytochrome bcc-aa? 超復合物，而Hhy也提供給 cytochrome bd 氧化酶復合物。結(jié)果表明，盡管相似，Huc和Hhy在分枝桿菌生長和生存中執(zhí)行 distinct 功能。

研究目的

本研究旨在解決以下核心問題：

 

探究Huc和Hhy在M. smegmatis生長和持久期的差異表達模式及活性動態(tài)。

確定這兩種氫酶如何整合到好氧呼吸鏈中，包括與終端氧化酶的特異性耦合。

理解它們與呼吸鏈組件（如menaquinone池）的相互作用及對質(zhì)子動勢（PMF）的依賴。

 

闡明大氣H?氧化作為能源在細菌生存中的生理作用，為微生物能量代謝提供新見解。

 

研究思路

研究采用多層次實驗策略：

 

遺傳學方法：構(gòu)建突變體 strains（Huc-only、Hhy-only、雙突變等），通過等位基因交換和StreplI標簽插入，驗證氫酶功能。

基因表達分析：使用qRT-PCR定量hucL和hhyL轉(zhuǎn)錄本在不同生長階段（指數(shù)期、靜止期、持久期）的表達水平。

酶活性測量：通過活性染色（zymography）和藍 native PAGE 檢測氫酶活性及分子質(zhì)量；使用丹麥Unisense H?和O?微電極實時測量整體細胞H?氧化和O?消耗速率。

細胞分餾與定位：Western blotting 分析氫酶在細胞質(zhì)和膜組分的分布，評估膜關聯(lián)強度。

呼吸鏈耦合實驗：應用呼吸抑制劑（如HQNO、鋅疊氮）和解偶聯(lián)劑（如valinomycin、nigericin），研究電子傳遞路徑和PMF依賴。

質(zhì)譜分析：鑒定活性染色條帶中的蛋白質(zhì)組分，揭示氫酶與呼吸鏈復合物的潛在相互作用。

 

數(shù)據(jù)整合：結(jié)合動力學測量和抑制劑響應，構(gòu)建氫酶整合模型。

 

測量數(shù)據(jù)及其研究意義

以下列出關鍵測量數(shù)據(jù)、其來源（圖編號）及研究意義：

 

基因表達與活性動態(tài)數(shù)據(jù)（來源：Figure 1）

 

數(shù)據(jù)：qRT-PCR顯示hucL在碳限制過渡期（1天 post-Amax）表達峰值（54倍誘導），隨后下降；hhyL在持久期（3周 post-Amax）高表達。H2氧化速率測量表明Huc活性在過渡期最高，Hhy活性在持久期顯著增強。

 

研究意義：證實Huc和Hhy的時序差異調(diào)節(jié)——Huc用于生長-休眠過渡的混合營養(yǎng)能量供應，Hhy用于長期持久維持，支持 survival 策略的分化。

 

酶活性與定位數(shù)據(jù)（來源：Figure 2）

 

數(shù)據(jù)：活性染色顯示Huc形成高分子質(zhì)量復合物（>700 kDa），Hhy為中分子質(zhì)量（~66 kDa）；Western blotting 顯示Huc部分膜關聯(lián)（膽酸鈉可溶），Hhy強膜關聯(lián)（膽酸鈉不溶）。

 

研究意義：表明Huc可能通過蛋白質(zhì)相互作用與膜結(jié)合（如與cytochrome bcc-aa?超復合物），而Hhy直接嵌入膜；這解釋了功能差異的結(jié)構(gòu)基礎。

 

呼吸耦合數(shù)據(jù)（來源：Figure 3）

 

數(shù)據(jù)：微電極測量顯示H2氧化依賴O2， stoichiometry 約2:1（H2:O2）；抑制劑實驗表明鋅疊氮（cytochrome bcc-aa?抑制劑）強烈抑制Huc活性（8.4倍降低），對Hhy影響小（1.5倍降低）。

 

研究意義：直接證明H2氧化耦合到呼吸鏈O2還原；Huc obligately 耦合 cytochrome bcc-aa?，Hhy promiscuously 耦合 cytochrome bd 和 bcc-aa?，顯示電子傳遞路徑的差異。

 

抑制劑響應數(shù)據(jù)（來源：Figure 4）

 

數(shù)據(jù)：HQNO（menaquinone抑制劑）抑制Huc和Hhy活性（8.6-10.4倍降低），證實電子傳遞通過menaquinone池；valinomycin（PMF解偶聯(lián)劑）強烈抑制Huc（20倍降低）但增強Hhy（1.3倍增加）。

 

研究意義：表明Huc依賴PMF（可能因耦合質(zhì)子泵氧化酶），Hhy不依賴且更靈活；突出能量代謝策略差異——Huc用于高效能量守恒，Hhy用于低維持成本。

 

整合模型（來源：Figure 5）

 

數(shù)據(jù)：示意圖總結(jié)Huc和Hhy電子傳遞路徑：Huc專一捐贈電子給cytochrome bcc-aa?（泵6H?），Hhy捐贈給cytochrome bd（泵2H?）或bcc-aa?。

 

研究意義：提供整體框架，解釋氫酶如何支持不同生理狀態(tài)；大氣H?作為關鍵能源，增強細菌在 oligotrophic 環(huán)境中的適應性。

 

研究結(jié)論

本研究得出以下核心結(jié)論：

 

功能分化：Huc和Hhy雖均氧化大氣H?，但時序和功能差異——Huc支持生長-休眠過渡的混合營養(yǎng)，耦合高效質(zhì)子泵氧化酶；Hhy支持長期持久，耦合低效氧化酶，提供維持能量。

呼吸鏈整合：兩者均通過menaquinone池傳遞電子，但耦合不同終端氧化酶；Huc依賴PMF，Hhy更靈活，適應多變環(huán)境。

生理意義：大氣H?氧化是M. smegmatis的核心生存策略，氫酶分化優(yōu)化了能量利用，解釋了其在土壤中的持久性。

 

廣泛適用性：類似機制可能存在于其他好氧細菌，強調(diào)痕量氣體代謝在微生物生態(tài)中的重要性。

 

丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的詳細解讀

在本研究中，丹麥Unisense微電極系統(tǒng)（H?和O?微電極）用于實時測量整體細胞的H?氧化和O?消耗速率，其研究意義主要體現(xiàn)在：

 

高分辨率實時監(jiān)測：Unisense電極提供μM級檢測限，允許在生理條件下（如PBS緩沖液，pH 7.4）實時追蹤H?和O?動力學（Figure 3a）。例如，直接顯示H?氧化速率隨O?添加而增加，證實呼吸耦合，且 stoichiometry 約2:1（H?:O?），符合 aerobic respiration 理論。

定量動力學參數(shù)：電極數(shù)據(jù)用于計算表觀速率（如Vmax和Km），并評估抑制劑效應（Figure 3b-c, 4）。例如，鋅疊氮處理導致Huc活性大幅降低，直接證明其與cytochrome bcc-aa?的特異性耦合。

原位與無擾動測量：電極直接在整體細胞懸浮液中測量，避免提取或純化帶來的擾動，確保數(shù)據(jù)生理相關性。這尤其重要 for 驗證氫酶在原生環(huán)境中的功能。

支持關鍵假設：數(shù)據(jù)證實H?氧化依賴O?，且電子傳遞通過呼吸鏈；抑制劑響應差異（如valinomycin對Huc和Hhy的相反效應）為PMF依賴提供直接證據(jù)，支撐功能分化模型。

 

技術優(yōu)勢：Unisense系統(tǒng)的靈敏度和實時性使其成為研究氣體代謝酶的理想工具，本研究通過結(jié)合遺傳和生化數(shù)據(jù)，強化了大氣H?作為能源的結(jié)論。

 

總之，丹麥Unisense電極數(shù)據(jù)是本研究的基石，通過提供精確的呼吸速率測量，它直接驗證了氫酶與呼吸鏈的耦合機制，揭示了Huc和Hhy的功能差異。這項技術突出了原位呼吸測量在微生物生理學研究中的價值，為理解細菌能量代謝提供了關鍵實證。