In Situ Monitoring of the Antibacterial Activity of a Copper-Silver Alloy Using Confocal Laser Scanning Microscopy and pH Microsensors

使用共聚焦激光掃描顯微鏡和pH微傳感器原位監(jiān)測銅銀合金的抗菌活性

來源：Global Challenges, Volume 3, 2019, Article ID 1900044

《全球挑戰(zhàn)》第3卷，2019年，文章編號1900044

 

摘要

這篇論文摘要闡述了研究團(tuán)隊(duì)成功證明了銅銀合金涂層在模擬干燥表面生物膜形成條件下的抗菌效力，按照美國EPA測試方法，在24小時(shí)內(nèi)對測試菌種的減少率≥99.9%。研究設(shè)計(jì)了一種定制的共聚焦成像方案，用于原位觀察銅銀合金表面細(xì)菌生物膜的殺滅過程并監(jiān)測其100分鐘內(nèi)的動(dòng)力學(xué)。銅銀合金涂層在5分鐘內(nèi)即可根除革蘭氏陽性菌生物膜，而對革蘭氏陰性菌生物膜的殺滅速度較慢。原位pH監(jiān)測表明，在金屬表面與細(xì)菌生物膜界面處pH值升高了2個(gè)對數(shù)單位；然而，在緩沖液中測試時(shí)，細(xì)菌的存活率并未直接受到此pH升高（pH 8.0-9.5）的影響。因此，在環(huán)境條件下，電化學(xué)活性表面與細(xì)菌生物膜相互作用導(dǎo)致的OH-生成，是銅銀合金涂層接觸介導(dǎo)殺滅的一個(gè)方面，而非觀察到的抗菌效力的直接原因。細(xì)菌細(xì)胞的氧化、銅離子的釋放以及局部pH升高的結(jié)合，共同表征了銅銀合金涂層干燥表面的抗菌活性。

 

研究目的

本研究旨在評估銅銀合金涂層在更接近真實(shí)使用條件（即干燥條件，允許細(xì)菌生物膜形成）下的抗菌活性，并探究其作用機(jī)制。具體目的是利用美國EPA測試方法驗(yàn)證其有效性，通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）原位觀察殺菌動(dòng)力學(xué)，并使用pH微傳感器監(jiān)測界面處的局部pH變化，以闡明pH升高在接觸殺滅過程中的作用。

 

研究思路

研究思路首先按照美國EPA的兩種測試方案（Protocol 1: 作為消毒劑的效力；Protocol 2: 持續(xù)減少細(xì)菌污染）驗(yàn)證銅銀合金涂層對多種細(xì)菌（包括金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA、產(chǎn)氣腸桿菌、銅綠假單胞菌）的抗菌效力。然后，設(shè)計(jì)了一種改良的活/死細(xì)胞染色方案，結(jié)合共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM），直接在銅銀合金涂層表面及未涂層的不銹鋼（AISI 316）對照表面原位、實(shí)時(shí)（100分鐘內(nèi)）觀察金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生物膜被殺滅的動(dòng)態(tài)過程。同時(shí)，使用丹麥Unisense的pH微電極，精確測量并監(jiān)測細(xì)菌懸液層與涂層表面界面處的局部pH變化。此外，通過將金黃色葡萄球菌暴露于不同pH（8.0-9.5）的緩沖液中，評估pH單獨(dú)對細(xì)菌存活的影響，以區(qū)分pH升高在殺菌機(jī)制中的直接作用。

 

測量的數(shù)據(jù)及研究意義

1. 抗菌效力數(shù)據(jù)：通過菌落形成單位計(jì)數(shù)，計(jì)算銅銀合金涂層在不同時(shí)間點(diǎn)（2, 6, 12, 18, 24小時(shí)）對測試菌種的減少百分比。數(shù)據(jù)顯示，涂層對所有測試菌種在24小時(shí)內(nèi)均達(dá)到≥99.9%的減少率（表1）。研究意義在于嚴(yán)格按照國際標(biāo)準(zhǔn)（US EPA）驗(yàn)證了該銅銀合金涂層在模擬真實(shí)干燥污染場景下的高效、廣譜抗菌性能，為其在醫(yī)療環(huán)境等實(shí)際應(yīng)用提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。

 

2. 原位殺菌動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)：通過CLSM圖像和生物量定量分析，顯示金黃色葡萄球菌在接觸銅銀合金涂層5分鐘內(nèi)活菌數(shù)量顯著下降，60分鐘內(nèi)大部分細(xì)胞死亡；而銅綠假單胞菌的殺滅速度較慢，活死細(xì)胞比例在60分鐘后才發(fā)生顯著轉(zhuǎn)變（圖1, 圖2, 圖3）。研究意義在于直觀、實(shí)時(shí)地揭示了涂層對不同類型細(xì)菌（革蘭氏陽性 vs. 革蘭氏陰性）的殺滅速率存在差異，提示細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)等因素可能影響其抗菌效果，并為優(yōu)化涂層應(yīng)用提供了時(shí)間動(dòng)力學(xué)依據(jù)。

 

 

 

3. 界面pH變化數(shù)據(jù)：使用Unisense pH微電極測量發(fā)現(xiàn)，在金黃色葡萄球菌懸液與銅銀合金涂層界面處，pH以約0.14單位/分鐘的速率上升，20分鐘內(nèi)達(dá)到pH 9.0以上平臺(tái)期；而在無細(xì)菌存在時(shí)，pH先快速升至9.5后因氧化亞銅形成而緩慢下降；不銹鋼對照表面pH則保持穩(wěn)定或略有下降（圖4, 圖5）。研究意義在于直接證實(shí)了涂層表面的電化學(xué)活性導(dǎo)致界面局部產(chǎn)生OH-，引起pH顯著升高，明確了這一現(xiàn)象是涂層與細(xì)菌相互作用的結(jié)果。

 

 

4. pH單獨(dú)作用評估數(shù)據(jù)：將金黃色葡萄球菌暴露于pH 8.0-9.5的Tris-HCl緩沖液中1小時(shí)和24小時(shí)，其存活率僅略有下降（約1個(gè)對數(shù)單位），遠(yuǎn)低于涂層接觸殺滅的效果（4-5個(gè)對數(shù)單位）（表2）。研究意義在于排除了所觀察到的pH升高范圍（8.0-9.5）是導(dǎo)致細(xì)菌大量死亡的主要原因，表明涂層的抗菌活性是多種因素協(xié)同作用的結(jié)果，而非單純由堿性環(huán)境引起。

 

結(jié)論

1. 銅銀合金涂層在模擬干燥表面生物膜形成的條件下，表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗菌效力，符合美國EPA標(biāo)準(zhǔn)，能在24小時(shí)內(nèi)持續(xù)減少多種細(xì)菌污染≥99.9%。

2. 原位CLSM監(jiān)測揭示了涂層對金黃色葡萄球菌生物膜的殺滅速度快于銅綠假單胞菌，表明細(xì)菌類型影響抗菌動(dòng)力學(xué)。

3. 涂層與細(xì)菌生物膜相互作用會(huì)引發(fā)電化學(xué)活性，導(dǎo)致界面局部pH顯著升高（至9.0以上），但這種pH升高本身并非觀察到的強(qiáng)力殺菌作用的主要直接原因。

4. 銅銀合金涂層的抗菌活性是細(xì)菌細(xì)胞氧化、銅離子釋放以及局部pH升高共同作用的結(jié)果，這種電化學(xué)驅(qū)動(dòng)的多重機(jī)制確保了其在預(yù)期環(huán)境應(yīng)用中的有效性。

 

使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義

使用丹麥Unisense pH微電極（型號PH25，尖端直徑約25μm）測量的數(shù)據(jù)在本研究中具有關(guān)鍵的研究意義。首先，該電極的高空間分辨率使其能夠精確放置在距離金屬表面不到100微米的位置，直接測量涂層與細(xì)菌生物膜界面處這一微小區(qū)域的實(shí)時(shí)pH變化，這是常規(guī)pH電極無法實(shí)現(xiàn)的。其快速響應(yīng)時(shí)間（90%響應(yīng)<10秒）成功捕捉到了pH的快速動(dòng)態(tài)變化，例如在無細(xì)菌存在時(shí)，涂層界面pH在4分鐘內(nèi)從約7.0迅速升至9.5以上，以及有細(xì)菌存在時(shí)pH以0.14單位/分鐘速率上升至平臺(tái)期。這些高精度、實(shí)時(shí)的數(shù)據(jù)直接證實(shí)了銅銀合金涂層作為一種電化學(xué)活性表面，在與含電解質(zhì)的環(huán)境（如細(xì)菌懸液或瓊脂糖基質(zhì)）接觸時(shí)，會(huì)發(fā)生還原反應(yīng)（O? + 2H?O + 4e? → 4OH?），導(dǎo)致界面處OH-離子積累和pH升高。這不僅為理解涂層的抗菌機(jī)制提供了關(guān)鍵的物理化學(xué)證據(jù)，還將觀察到的現(xiàn)象（殺菌）與潛在的機(jī)制（電化學(xué)反應(yīng)引起的局部環(huán)境改變）聯(lián)系起來。通過對比有/無細(xì)菌存在時(shí)的pH變化曲線，Unisense電極的數(shù)據(jù)還幫助揭示了細(xì)菌生物膜的存在影響了反應(yīng)的平衡狀態(tài)（減緩了pH上升速率并形成平臺(tái)），暗示生物質(zhì)參與了電化學(xué)過程。此外，結(jié)合緩沖液實(shí)驗(yàn)，電極測量的pH數(shù)據(jù)幫助排除了所測pH范圍（8.0-9.5）是殺菌主要直接原因的可能性，從而更準(zhǔn)確地界定pH升高在復(fù)雜抗菌機(jī)制中的角色（協(xié)同因素而非主導(dǎo)因素）。總之，Unisense微電極的應(yīng)用使得研究能夠超越宏觀觀察，深入到微觀界面過程，為闡明銅銀合金涂層基于電化學(xué)原理的抗菌機(jī)制提供了不可或缺的定量和動(dòng)態(tài)信息。