Low-temperature culturing improves survival rate of tissue-engineered cardiac cell sheets

低溫培養提高組織工程心肌細胞的存活率

來源：Biochemistry and Biophysics Reports 14 (2018) 89–97

 

論文總結

研究了低溫培養（20-33.5°C）對三維組織工程心臟細胞片存活率的影響。通過降低細胞代謝率，低溫培養改善了高密度心肌組織的存活和血管網絡形成，為器官工程提供了新策略。以下從摘要、研究目的、研究思路、測量數據及意義、結論等方面進行總結，并詳細解讀使用丹麥Unisense電極測量數據的研究意義。

一、論文摘要

研究通過細胞片技術構建三維心臟組織，比較了低溫培養（20-33.5°C）與標準培養（37°C）對心肌細胞存活率、代謝和血管網絡形成的影響。結果表明，低溫培養（尤其是30°C）能顯著降低細胞代謝（如葡萄糖消耗和乳酸產生），減少細胞死亡，并促進內皮細胞形成前血管網絡。移植實驗證實，低溫處理的細胞片在裸鼠體內具有更好的存活率和功能整合。研究提出低溫培養作為一種簡單有效的方法，可用于高代謝組織如心臟的工程化構建。

二、研究目的

 

開發低溫培養策略：通過降低培養溫度（20-33.5°C）減少心肌細胞代謝率，解決三維高密度組織因營養供應不足導致的壞死問題。

評估細胞存活與功能：分析低溫對心肌細胞存活、代謝活性及血管網絡形成的調控作用。

 

驗證移植效果：比較低溫和標準培養的細胞片在活體移植后的存活率和功能恢復，為臨床應用提供依據。

 

背景基于三維組織工程中血管化難題，傳統37°C培養無法支持高代謝細胞（如心肌細胞）的長期存活，而低溫可能模擬體內低代謝狀態，改善組織健康。

三、研究思路

研究采用細胞片工程結合多尺度分析：

 

細胞片制備：從新生大鼠心室分離心肌細胞，在溫度響應培養皿上培養成單層細胞片，進而堆疊成三層或五層三維組織。

溫度梯度實驗：在19.5°C、23°C、26.5°C、30°C、33.5°C和37°C下培養3-7天，分析代謝、存活和血管網絡。

多參數測量：包括細胞存活（活細胞計數、LDH泄漏）、代謝指標（葡萄糖消耗、乳酸產生、氧氣濃度）、組織學（H&E染色、肌鈣蛋白T免疫染色）和血管網絡長度。

功能驗證：將五層細胞片移植至裸鼠皮下，評估移植后組織存活、血管化和電生理功能。

 

數據分析：使用成像軟件（如Image J）和流式細胞術量化結果，統計方法包括方差分析。

 

四、測量數據、來源及研究意義

研究測量了多維度數據，其意義及來源如下（數據均標注自原文圖/表）：

 

細胞存活與代謝數據（數據來自Fig. 1）：

 

數據：單層細胞片在所有溫度下均存活，但三層和五層細胞片在33.5°C以上死亡細胞增加（Fig. 1F-G）；葡萄糖消耗和乳酸產生隨溫度降低而減少（Fig. 1D-E），例如30°C時葡萄糖消耗比37°C低約40%。

 

研究意義：直接證實低溫降低細胞代謝，緩解高密度組織的營養壓力；為優化培養溫度提供定量依據（最佳范圍為30-33.5°C）。

 

氧氣濃度數據（數據來自正文3.1節和補充圖S1，但主文檔無對應圖片標簽，故不嵌入）：

 

數據：使用Unisense氧微電極測量，30°C和37°C的氧濃度梯度分別為1.27±0.06和1.61±0.06 mg/L/mm，氧消耗率分別為0.16±0.001和0.27±0.001 pmol/h/cell。

 

研究意義：量化代謝抑制，低溫下氧消耗降低37%，表明細胞呼吸減弱，支持代謝調控假說。

 

組織學與細胞比例數據（數據來自Fig. 2）：

 

數據：H&E染色顯示，37°C培養的五層細胞片出現核丟失和層間間隙，而30°C時組織致密（Fig. 2A-F）；流式細胞術測心肌細胞比例，低溫培養（≤30°C）維持約40%，37°C降至15%（Fig. 2G）。

 

研究意義：揭示高溫導致心肌細胞特異性死亡，低溫保護細胞結構完整性，強調溫度對細胞類型的差異影響。

 

血管網絡形成數據（數據來自Fig. 3）：

 

 

數據：GFP標記內皮細胞顯示，33.5°C時血管網絡長度最大（Fig. 3A-G）；37°C培養5天后網絡停滯，而33.5°C持續發展至7天（Fig. 3G）。

 

研究意義：中低溫（30-33.5°C）平衡細胞存活與血管生成，解決工程組織血管化難題；流式細胞術驗證內皮細胞比例下降與網絡長度一致（Fig. 3H）。

 

移植效果數據（數據來自Fig. 4）：

 

數據：低溫處理（30°C）的五層細胞片移植后血管網絡更密集（Fig. 4B-C），組織存活率更高（Fig. 4F-H），肌鈣蛋白T陽性區域面積增大（11,530±4550 μm2 vs 標準處理8,302±2700 μm2）。

 

研究意義：證實低溫培養提升移植體存活和功能整合，為再生醫學提供實踐方案；電生理測量顯示移植體具有收縮功能。

 

五、研究結論

 

低溫提升存活率：培養溫度≤30°C時，三層和五層細胞片存活率顯著提高，心肌細胞比例維持40%以上，而37°C時大量死亡。

代謝抑制是關鍵：低溫降低葡萄糖消耗、乳酸產生和氧消耗，減少氧化應激，改善細胞微環境。

血管網絡優化：30-33.5°C促進內皮細胞形成可持續血管網絡，避免37°C下的停滯。

移植成功驗證：低溫處理細胞片在活體內血管化良好、功能完整，支持其臨床轉化潛力。

 

應用價值：為高代謝組織（如心臟、肝臟）工程提供低溫培養策略，克服傳統方法限制。

 

六、詳細解讀使用丹麥Unisense電極測量出來的數據有什么研究意義

丹麥Unisense電極（具體為Clark型氧微傳感器，型號OX-50）在本研究中用于原位測量細胞片培養介質中的氧氣濃度梯度，其研究意義如下：

 

高分辨率代謝量化：

 

技術描述：Unisense氧微傳感器具有微米級尖端，可穿透培養介質，以100μm間隔測量溶解氧濃度，提供實時空間梯度數據（如濃度變化率mg/L/mm）。

研究應用：在單層細胞片上測量30°C和37°C的氧濃度分布，計算氧消耗率（正文3.1節，數據來自補充圖S1）。

 

研究意義：直接量化細胞呼吸強度——37°C時氧消耗率（0.27 pmol/h/cell）顯著高于30°C（0.16 pmol/h/cell），證實低溫抑制代謝活性，為“代謝降低假說”提供實證基礎。

 

揭示三維組織生存機制：

 

數據關聯：氧梯度數據與細胞存活結果（Fig. 1）耦合：高溫下氧消耗快，導致深層細胞缺氧壞死；低溫下氧需求減少，緩解擴散限制。

 

研究意義：闡明三維組織存活瓶頸不僅是營養供應，還包括氧動態平衡；Unisense數據幫助定位最佳溫度（30°C），使代謝與氧供應匹配。

 

支持代謝指標驗證：

 

校準作用：氧消耗率與葡萄糖消耗、乳酸產生數據（Fig. 1D-E）一致，共同構建代謝全景——低溫全面抑制糖酵解和氧化磷酸化。

 

研究意義：增強多參數測量的可靠性，避免單一指標偏差；氧數據作為代謝“金標準”，驗證低溫培養的生理合理性。

 

技術優勢與推廣價值：

 

原位與非侵入性：傳感器無需取樣，保持培養系統完整性，避免擾動細胞微環境。

 

研究意義：凸顯Unisense電極在組織工程中的實用性，尤其適用于三維系統的高通量篩查；方法可推廣至其他高代謝組織（如肝、腦）的氧動態研究。

 

綜上，Unisense電極數據是連接低溫培養與細胞存活的核心橋梁：通過精準氧測量，不僅證實代謝抑制機制，還為優化培養條件提供了關鍵參數，推動組織工程從經驗性向定量化發展。這一技術的應用有望加速臨床級組織構建的標準化進程。