Measurement of the Extracellular pH of Adherently Growing Mammalian Cells with High Spatial Resolution Using a Voltammetric pH Microsensor

使用伏安法pH微傳感器高空間分辨率測量貼壁生長哺乳動物細胞的細胞外pH

來源: Analytical Chemistry, 2018, Volume 90, Pages 6899-6905

《分析化學》，2018年，第90卷，第6899-6905頁

 

摘要：

這篇論文的摘要指出，目前缺乏高空間分辨率測量貼壁生長哺乳動物細胞細胞外pH（pHe）的工具，細胞生物學家通常局限于使用商業熒光探針測量細胞內pH。因此，作者開發了一種伏安法pH微傳感器，由修飾了還原氧化石墨烯和syringaldazine的碳纖維微電極組成，用于監測細胞外pH。該傳感器具有良好的靈敏度（60±2.5 mV/pH單位）、重現性（系數變異≤3%）和穩定性（3小時內pH漂移約0.05單位），并成功用于研究癌癥細胞和正常細胞細胞外空間的酸化，揭示了細胞pH調節的細節，這些細節無法用缺乏空間分辨率或無法精確定位的pH傳感器獲得。

 

研究目的：

研究目的是開發一種高空間分辨率的伏安法pH微傳感器，用于測量貼壁生長哺乳動物細胞的細胞外pH，以克服現有工具的局限性，如熒光方法的淬滅和光漂白問題，或電化學傳感器的易碎性和響應時間長問題。最終目標是能夠以高空間分辨率監測細胞外pH，從而研究細胞異質性，特別是在癌癥細胞中pH調節的差異。

 

研究思路：

研究思路首先聚焦于構建和優化pH微傳感器。具體步驟包括：制造碳纖維微電極（直徑37μm），通過吸附石墨烯氧化物和syringaldazine進行修飾，然后電化學還原石墨烯氧化物以增加電化學活性表面積。傳感器校準使用已知pH值的溶液，通過循環伏安法記錄syringaldazine的氧化還原峰電位與pH的關系。隨后，使用掃描電化學顯微鏡（SECM）將傳感器精確定位在細胞外空間（距離細胞約24-29μm），測量近細胞處pH（pHclose）和遠離細胞處pH（pHfar），計算pH梯度。實驗對象包括人類結直腸腺癌細胞（HT-29，在常氧和缺氧條件下）和正常人類胚胎腎細胞（HEK-293，轉染和非轉染），以比較不同細胞類型的pHe差異。

 

測量的數據及研究意義：

1. pH微傳感器的靈敏度數據：通過校準曲線得到靈敏度為60±2.5 mV/pH單位，接近理論值（59 mV/pH單位）。這些數據來自圖2，其中顯示了循環伏安圖和校準曲線。研究意義：驗證傳感器性能，確保其能準確測量生物相關pH范圍，為細胞實驗提供可靠工具。

 

2. pH微傳感器的重現性數據：通過五組傳感器測試，顯示系數變異≤3%，表明傳感器構建一致。這些數據來自圖3，顯示了平均校準曲線。研究意義：確保傳感器可重復使用，減少實驗誤差，提高數據可靠性。

 

3. pH微傳感器的穩定性數據：在3小時內pH漂移約0.05單位，表明傳感器適合長時間實驗。這些數據來自圖4，顯示了pH隨時間的變化。研究意義：證明傳感器在細胞測量中穩定，能夠捕捉細微pH變化而不受漂移影響。

 

4. 細胞外pH測量數據：測量了不同細胞類型的pHclose和pHfar，計算pH梯度。例如，缺氧HT-29細胞平均pHe為7.03，常氧HT-29為7.13，正常細胞為7.18-7.21，并顯示pH梯度分布。這些數據來自圖5，顯示了pH梯度的百分比分布。研究意義：揭示細胞異質性，癌癥細胞具有更酸性細胞外空間，且缺氧細胞pH梯度更大，有助于理解癌癥細胞pH調節機制和異質性對治療的影響。

 

 

結論：

論文得出結論，開發的伏安法pH微傳感器通過還原氧化石墨烯增強，具有高靈敏度、重現性和穩定性，結合SECM精確定位，能夠高空間分辨率測量細胞外pH。研究發現，癌癥細胞（尤其是缺氧條件下）細胞外空間更酸性，且癌癥細胞表現出更高的pH梯度異質性，而正常細胞pH梯度較均勻。這證明了傳感器能捕捉細胞pH調節的細節，為研究細胞異質性和疾病機制提供了新工具。未來可通過減小傳感器尺寸和優化SECM實現單細胞測量。

 

使用丹麥Unisense電極測量數據的研究意義：

論文中提及丹麥Unisense A/S的玻璃pH微傳感器作為現有高空間分辨率pH測量工具的例子，用于測量細菌生物膜等系統的pH。但論文指出，這類電位法傳感器易碎、響應時間長、需要光學顯微鏡輔助定位，且壽命有限。因此，Unisense電極的數據研究意義在于它突出了現有工具的局限性，強調了開發更優傳感器（如本論文的伏安法傳感器）的必要性。Unisense電極在其他研究中證明了高空間分辨率pH測量的可行性，但本論文的傳感器通過伏安法克服了缺點，如更易定位、更快響應，從而更適用于哺乳動物細胞研究，推動細胞pH測量技術的發展。