Sensing oxygen at the millisecond time-scale using an ultra-microelectrode array (UMEA)

利用超微電極陣列對氧進行毫秒級的傳感

來源：Sensors and Actuators B 238 (2017) 1008–1016

 

一、論文摘要

本研究報道了一種新穎的傳感協議，該協議基于超短時間測量（<5毫秒），并采用一種專用的超微電極陣列（UMEA）傳感器，用于監測溶液中的溶解氧濃度。該UMEA傳感器由鉑（Pt）制成，以氧化物-氮化物-氧化物（ONO）作為絕緣材料，電極凹嵌在玻璃基底中。傳感器在其線性區域內工作，溶液中的氧濃度可在不到5毫秒內從測得的電流（I）與時間的平方根倒數（1/√t）關系曲線的斜率中推導出來。為驗證所提出的測量協議并校準傳感器，在一個10毫升的濕池中，使用UMEA傳感器和一個外部的電化學傳感器同步監測溶解氧濃度的變化。兩種傳感器的測量結果表現出極好的一致性（R2 = 0.994），并確定UMEA傳感器在此超短測量模式下的靈敏度為0.49 nA·s??.? / mg/L。最終，也是最重要的一點，在這種配置下進行電化學測量所消耗的氧氣量被極大地減少了，與商用電化學傳感器相比減少了約10個數量級，這對于在微流控系統中原位監測納升級體積內微組織（如細胞團）的呼吸活性具有極高價值。

二、研究目的

本研究旨在解決在微流控系統等極小體積環境中進行實時、原位氧濃度監測時面臨的核心挑戰：傳統氧傳感器因測量過程自身消耗氧氣過多，會嚴重干擾被測生物樣本（如細胞、微組織）的生存微環境。具體目標包括：

 

開發一種超低耗氧的氧傳感技術：通過結合超微電極陣列（UMEA）和超短時間測量協議（毫秒級），從根本上減少單次測量所消耗的氧氣量，避免對納升級樣本的氧環境造成顯著擾動。

驗證超短時間測量協議的可行性：探索在非穩態擴散的線性區域（Cottrell區）進行測量的可能性，并建立從電流-時間數據中快速提取氧濃度的校準方法。

全面表征傳感器性能：對自制UMEA傳感器進行物理表征（尺寸、形貌）和電化學表征，確保其符合理論模型，并評估其靈敏度、線性度和重現性。

 

展示技術在微流控應用中的潛力：通過證明其極低的氧氣消耗和快速響應能力，為該技術最終集成到微流控設備中，用于長期、無損地監測微量生物樣本的代謝活動奠定基礎。

 

三、研究思路

研究遵循了從理論設計 -> 傳感器制備 -> 性能表征 -> 協議驗證的系統性思路：

 

理論設計與傳感器設計：基于微電極擴散理論，設計一種電極間距足夠大、且凹嵌在基底中的UMEA結構。這種設計旨在確保在毫秒級測量時間內，每個微電極的擴散場保持獨立且呈平面擴散，從而使總電流遵循Cottrell方程（電流 I ∝ 1/√t），并極大縮短達到穩態擴散所需的時間。傳感器集成了工作電極（UMEA）、對電極和參比電極。

傳感器制備與優化：采用標準的微加工技術（光刻、濺射、lift-off、反應離子刻蝕等）在玻璃基底上制備Pt UMEA傳感器。針對初期工藝中出現的電極開口不徹底、絕緣層剝離等問題，優化了工藝流程，包括增加鈦粘附層、將電極凹嵌以及引入Piranha溶液和HF的后期處理步驟以徹底清潔和打開Pt電極表面。

物理與電化學表征：

 

物理表征：使用原子力顯微鏡（AFM）和掃描電子顯微鏡（SEM）精確測量UMEA中每個微電極的實際直徑（~2.09 μm）和凹嵌深度（~390 nm），為理論計算提供準確參數。

 

電化學表征：使用鐵氰化鉀作為模型氧化還原對，通過循環伏安法（CV）驗證傳感器的穩態行為，并將實驗測得的穩態電流與理論值比較，以確認所有微電極均已正確打開且功能正常。

 

氧傳感協議開發與驗證：

 

確定工作電位：通過CV在含氧和無氧溶液中確定氧還原的最佳工作電位（-0.2 V vs. Ag/AgCl）。

實施超短時測量：在確定的電位下施加10毫秒的脈沖，但僅采集前5毫秒的電流數據（采樣率24 μs），以確保測量在擴散的線性區內進行。

數據解析：將采集的電流數據對1/√t作圖，取其線性區域的斜率作為傳感器響應值，該斜率與氧濃度成正比。

 

同步校準與驗證：在進行UMEA測量的同時，使用一個商用的、經過校準的Unisense微Clark氧電極同步、獨立地測量溶液中的絕對氧濃度，從而建立UMEA傳感器響應值與真實氧濃度之間的校準曲線，并驗證其準確性。

 

四、測量數據、研究意義及來源

研究者測量了多個層面的數據，其意義和來源如下：

 

UMEA傳感器的物理尺寸（直徑、凹嵌深度）：通過AFM和SEM測量。

 

研究意義：這是所有理論計算和性能預測的基礎。精確的幾何尺寸對于計算理論穩態電流、判斷擴散場是否重疊以及確定線性測量時間窗口至關重要。數據顯示制備的傳感器與設計規格高度一致（文檔圖3及其對應描述），證明了微加工工藝的可靠性和可控性，確保了后續電化學測試結果的可解釋性。

 

數據來源：UMEA傳感器的整體結構和單個微電極的SEM圖像展示在 文檔圖3中。AFM和SEM測量的具體尺寸數據在論文正文的“4.2. Physical characterization of the UMEA”部分給出。

 

鐵氰化鉀中的循環伏安曲線和穩態電流：使用不同濃度鐵氰化鉀溶液測試傳感器的CV行為。

 

研究意義：用于驗證UMEA傳感器的基本電化學功能是否正常，并確認其具有微電極的典型特征（呈S形的穩態伏安曲線）。穩態電流與鐵氰化鉀濃度（文檔圖4A, B）以及傳感器中微電極數量（文檔圖4C, D）的線性關系，強有力地證明了傳感器按設計工作，每個微電極獨立貢獻，且制備成功率高。實驗值與理論值的良好吻合（誤差<10%）進一步證實了這一點。

 

 

數據來源：不同濃度鐵氰化鉀下的CV曲線以及穩態電流與濃度/微電極數量的關系圖展示在 文檔圖4中。具體的實驗與理論電流值對比列于 文檔中表1。

 

氧還原的循環伏安曲線：在含氧和無氧溶液中掃描CV。

 

研究意義：用于確定進行氧還原反應的最佳工作電位。CV曲線（文檔圖5A）清晰顯示在-0.4 V至0.1 V（vs. Ag/AgCl）電位區間內有明顯的氧還原電流，從而幫助研究者選擇-0.2 V作為后續計時安培測量的固定電位，以在保證靈敏度的同時盡量避免析氫等副反應。

 

數據來源：在空氣飽和及缺氧溶液中的CV曲線展示在 文檔圖5A中。

 

超短時測量下的原始電流-時間數據及轉換后的I vs. 1/√t圖：在氧濃度變化過程中，記錄毫秒級的電流瞬態響應。

 

研究意義：這是超短時測量協議的核心數據。原始的電流-時間曲線（文檔圖5B）和轉換后的I vs. 1/√t圖（文檔圖5C, D）直觀展示了傳感器在毫秒尺度的響應。在1.1至4.4毫秒區間內呈現的良好線性關系，直接驗證了在該時間窗口內擴散確實處于平面線性擴散模式（Cottrell區），從而證明了該測量協議的物理基礎是成立的。這是能夠從斜率快速計算氧濃度的前提。

 

數據來源：不同氧濃度下的計時安培曲線（I-t）及其轉換后的I vs. 1/√t圖展示在 文檔圖5B, C, D中。

 

UMEA傳感器響應值與Unisense測得的氧濃度的校準曲線：將UMEA的斜率響應值與同步測量的絕對氧濃度進行關聯。

 

研究意義：這是將UMEA的原始電信號轉化為精確氧濃度值的最終、也是最重要的一步。得到的高度線性（R2 = 0.994）且連續三天可重復的校準曲線（文檔圖5E），無可辯駁地證明了這種超短時測量協議的整體準確性和可靠性。它表明，即使在毫秒級時間內，UMEA傳感器也能穩定、準確地量化溶解氧濃度。

 

數據來源：UMEA傳感器響應值（斜率）與由Unisense電極測得的氧濃度之間的校準曲線展示在 文檔圖5E中。

 

五、研究結論

 

成功開發并驗證了一種超快、超低耗氧的氧傳感方案：研究證實，將定制化的UMEA傳感器與小于5毫秒的超短時測量協議相結合，可以實現對溶解氧濃度的精確測量，同時將測量過程本身的氧氣消耗量降至飛摩爾級別。

理論預測與實驗結果高度吻合：傳感器對鐵氰化鉀的響應電流與基于其精確物理尺寸的理論計算值高度一致，證明了傳感器設計的合理性和制備工藝的精確性。在氧測量中，傳感器響應在毫秒時間內確實遵循Cottrell方程，驗證了超短時測量協議的理論基礎。

耗氧量實現了數量級的降低：計算表明，單次測量耗氧量僅約63 fmol，相對于10 mL溶液，氧濃度變化僅約10??%。與商用Unisense Clark電極相比，耗氧量降低了約10個數量級。這是該技術最核心的優勢。

 

為微流控生物應用鋪平道路：這種可忽略不計的耗氧和毫秒級的快速測量能力，使得該技術非常適合集成到納升體積的微流控芯片中，用于長期、原位、實時地監測細胞、胚胎或微組織等微量生物樣本的呼吸代謝活性，而不會對樣本的生存環境造成干擾。

 

六、使用丹麥Unisense電極測量數據的研究意義詳解

在本研究中，丹麥Unisense的OX 500微型Clark氧電極被用作一個獨立的、經過校準的“黃金標準”參考傳感器，在10 mL的濕池實驗中同步、連續地監測溶液的絕對溶解氧濃度。

其研究意義是根本性的，是驗證本研究核心創新點——超短時測量協議的準確性和可靠性的關鍵參照系，具體體現在：

 

提供了無可爭議的濃度基準：UMEA傳感器在超短時測量中提供的是一個相對的電流信號（斜率）。這個信號本身無法直接給出氧濃度的絕對值。Unisense電極作為一個成熟、商用的標準傳感器，其測量結果被廣泛認可。通過同步測量，研究者可以將UMEA的相對響應信號與Unisense測得的絕對氧濃度值一一對應起來（文檔圖5E）。沒有Unisense電極提供的這個基準，UMEA傳感器的讀數將無法被校準，其測量結果的真實性也無從驗證。

實現了對UMEA傳感器性能的定量評估：通過繪制校準曲線，研究者可以定量地計算出UMEA傳感器的靈敏度（0.49 nA·s??.? / mg/L）、線性范圍（R2 = 0.994）和日間重現性。這些關鍵的性能指標完全依賴于Unisense電極所提供的準確濃度值。Unisense電極在這里扮演了“計量標準器”的角色，使得UMEA傳感器的性能可以被客觀、量化地評價。

為“低耗氧”這一核心優勢提供了對比基準：論文中提到的“耗氧量降低10個數量級”這一驚人結論，是通過與Unisense這類商用電化學傳感器的典型耗氧量進行對比得出的。Unisense電極的性能參數作為一個公認的參考點，極大地凸顯了本研究提出的新技術在“最小化測量干擾”方面的巨大突破和優勢。

 

增強了研究成果的可信度：使用一個獨立的、商業化的標準儀器進行驗證，而不是僅僅依賴理論計算或自身系統的閉環比較，極大地增強了實驗結論的可信度和說服力。它向讀者表明，UMEA的超短時測量協議得到了一種外部、成熟技術的支持，避免了可能存在的自我驗證偏差。

 

總結：丹麥Unisense氧電極在本研究中扮演了 “精確測量的錨點”和“性能驗證的裁判”的角色。它提供的連續、可靠的絕對氧濃度數據，是將UMEA傳感器的原始電信號轉化為有物理意義的化學信息，并最終證明其超快、超低耗氧測量能力的基石。沒有Unisense電極作為外部標準，本研究將無法令人信服地證實其新測量協議的準確性，其核心創新價值也會大打折扣。因此，Unisense電極的貢獻在于為確保該研究的科學嚴謹性和結論的可靠性提供了不可或缺的、權威的第三方驗證。