Structural and functional characterization of the hydrogenase-maturation HydF protein

氫化酶成熟蛋白 HydF 的結(jié)構(gòu)與功能特性分析

來源：nature CHEMICAL BIOLOGY | VOL 13 | JULY 2017

 

論文摘要總結(jié)

本文報道了對氫酶成熟蛋白HydF的結(jié)構(gòu)與功能表征。HydF是[FeFe]氫酶成熟過程中的關(guān)鍵支架蛋白，負(fù)責(zé)組裝2Fe亞簇前體并將其轉(zhuǎn)移至氫酶。研究首次解析了來源于Thermosipho melanesiensis的HydF蛋白（TmeHydF）與其[4Fe-4S]簇結(jié)合的X射線晶體結(jié)構(gòu)（分辨率2.8 ?）。該簇由三個保守的半胱氨酸和一個可交換的谷氨酸（Glu305）配位。研究證實(shí)，合成的2Fe亞簇類似物[Fe?(adt)(CO)?(CN)?]2?（化合物1）可與HydF結(jié)合形成雜交蛋白（1-HydF），并能有效成熟氫酶。其FTIR光譜與天然宿主中純化的HydF活性中間體高度相似，表明1可能是真實(shí)的2Fe前體。此外，化學(xué)修飾的HydF（2-HydF）表現(xiàn)出氫酶活性，為開發(fā)人工氫酶提供了新途徑。

研究目的

本研究旨在解決以下關(guān)鍵問題：

 

解析HydF的精細(xì)結(jié)構(gòu)：闡明其[4Fe-4S]簇的配位模式（長期存在爭議），明確其作為支架蛋白的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

揭示2Fe亞簇組裝機(jī)制：探究HydF如何結(jié)合由HydE和HydG合成的配體（如adt2?、CO、CN?），并組裝成2Fe前體。

驗(yàn)證合成類似物的功能性：評估化合物1和2（含pdt2?配體）能否模擬天然中間體，并研究其成熟氫酶的能力。

 

探索人工氫酶潛力：通過構(gòu)建HydF-合成復(fù)合物雜交體，測試其直接催化產(chǎn)氫的活性。

 

研究思路

 

蛋白質(zhì)制備與重構(gòu)：

 

選擇嗜熱菌T. melanesiensis的HydF進(jìn)行異源表達(dá)，通過加熱和凝膠過濾純化獲得脫輔基蛋白（apo-HydF）。

 

在嚴(yán)格厭氧條件下，利用鐵銨鹽、L-半胱氨酸和脫硫酶CsdA重構(gòu)[4Fe-4S]簇，獲得全酶（FeS-TmeHydF）。

 

結(jié)構(gòu)解析與表征：

 

通過X射線晶體學(xué)解析FeS-TmeHydF的三維結(jié)構(gòu)，利用反常散射確定簇的位置。

 

使用UV-Vis光譜、EPR、HYSCORE和FTIR光譜表征簇的電子性質(zhì)和配體環(huán)境。

 

功能驗(yàn)證：

 

將化合物1或2與FeS-TmeHydF孵育制備雜交蛋白，通過鐵定量、FTIR和HYSCORE驗(yàn)證結(jié)合。

測試雜交蛋白對Megasphaera elsdenii氫酶（HydA）的成熟效率（通過二硫化物-甲基紫精法和氣相色譜檢測H?產(chǎn)量）。

 

使用丹麥Unisense氫微傳感器直接測量2-HydF雜交體的產(chǎn)氫活性。

 

突變體驗(yàn)證：構(gòu)建E305H和E305C突變體，評估Glu305在簇配位和2Fe復(fù)合物結(jié)合中的關(guān)鍵作用。

 

測量數(shù)據(jù)及研究意義

 

晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)（來自圖2b-d）：

 

數(shù)據(jù)內(nèi)容：顯示[4Fe-4S]簇由Cys298、Cys349、Cys352和Glu305配位；簇暴露于溶劑，鄰近帶正電的空腔可能用于結(jié)合2Fe前體。

 

研究意義：首次明確HydF簇的配位模式，顛覆了此前關(guān)于組氨酸或水分子作為第四配體的假設(shè)；Glu305的可交換性為前體結(jié)合提供了結(jié)構(gòu)靈活性。

 

HYSCORE光譜數(shù)據(jù)（來自圖3）：

 

數(shù)據(jù)內(nèi)容：加入咪唑后，在(5.5, 2.4) MHz處出現(xiàn)雙量子特征峰，表明咪唑取代了Glu305與簇結(jié)合。

 

研究意義：直接證明Glu305的配位具有可交換性，支持其在2Fe前體結(jié)合中的調(diào)節(jié)作用。

 

FTIR光譜數(shù)據(jù)（來自圖4）：

 

數(shù)據(jù)內(nèi)容：1-TmeHydF和2-TmeHydF在1,800–2,100 cm?1范圍內(nèi)顯示尖銳的C-O和C-N伸縮振動峰，與天然HydF中間體光譜高度相似。

 

研究意義：證實(shí)合成復(fù)合物在蛋白環(huán)境中保持完整性，且1可能是天然2Fe前體的準(zhǔn)確模擬物。

 

氫酶活性數(shù)據(jù)（來自圖5）：

 

數(shù)據(jù)內(nèi)容：2-TmeHydF的產(chǎn)氫轉(zhuǎn)換頻率（TOF）為0.3 min?1，比游離化合物2高30倍，但比成熟氫酶（2-HydA）低20–30倍。

 

研究意義：首次證明化學(xué)修飾的HydF可直接催化產(chǎn)氫，為構(gòu)建人工氫酶提供了概念驗(yàn)證。

 

突變體數(shù)據(jù)（來自補(bǔ)充圖13-15）：

 

數(shù)據(jù)內(nèi)容：E305H和E305C突變體難以結(jié)合化合物1或2，且簇重構(gòu)效率降低。

 

研究意義：凸顯Glu305在維持簇穩(wěn)定性及2Fe前體結(jié)合中的不可替代性。

 

結(jié)論

 

結(jié)構(gòu)創(chuàng)新：HydF的[4Fe-4S]簇由三半胱氨酸一谷氨酸配位，Glu305的可交換性為2Fe前體結(jié)合提供了動態(tài)機(jī)制。

功能模擬：化合物1是天然2Fe前體的理想模擬物，其與HydF形成的雜交體能高效成熟氫酶。

人工酶潛力：2-HydF雜交體具有直接產(chǎn)氫活性，雖效率低于天然氫酶，但為理性設(shè)計人工催化劑奠定了基礎(chǔ)。

 

進(jìn)化意義：Glu305在98%的細(xì)菌HydF中保守，表明該配位模式在進(jìn)化中具有優(yōu)勢。

 

詳細(xì)解讀使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的意義

丹麥Unisense氫微傳感器在本研究中用于直接檢測溶液中的氫氣濃度，其測量數(shù)據(jù)的意義如下：

 

高靈敏度檢測低活性系統(tǒng)：

 

數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)：圖5a顯示2-TmeHydF的TOF僅0.3 min?1，而傳統(tǒng)氣相色譜法難以檢測如此低活性。Unisense電極的檢測限極低（可測nM級H?），成功捕獲了雜交體的微弱產(chǎn)氫信號。

 

研究意義：避免了放射性標(biāo)記或間接化學(xué)法的復(fù)雜性，為低活性人工酶系統(tǒng)的功能評估提供了可靠工具。

 

實(shí)時動力學(xué)監(jiān)測：

 

數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)：圖5b顯示產(chǎn)氫反應(yīng)在加入連二亞硫酸鈉后立即開始，并在數(shù)分鐘內(nèi)達(dá)到平臺期。

 

研究意義：電極的時間分辨率（1秒/點(diǎn)）揭示了2-HydF的催化啟動速度及穩(wěn)定性缺陷（活性快速衰減），為優(yōu)化催化劑壽命提供了關(guān)鍵參數(shù)。

 

定量比較活性差異：

 

數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)：通過校準(zhǔn)曲線將電流信號轉(zhuǎn)換為H?濃度，精確量化了2-HydF（TOF=0.3 min?1）、游離化合物2（TOF=0.01 min?1）和成熟2-HydA（TOF=10 min?1）的活性差異。

 

研究意義：明確證實(shí)蛋白環(huán)境對合成復(fù)合物的催化增強(qiáng)作用（30倍），凸顯了支架蛋白在促進(jìn)催化中的關(guān)鍵角色。

 

支持人工氫酶開發(fā)：

 

技術(shù)優(yōu)勢：Unisense電極無需采樣、可實(shí)時監(jiān)測微升體積樣品，特別適合高通量篩選突變體或條件優(yōu)化。

 

應(yīng)用延伸：該技術(shù)可直接應(yīng)用于自然水體或生物膜系統(tǒng)中的氫代謝研究，為人工光合作用系統(tǒng)的原位評估提供了方法學(xué)支持。

 

綜上，Unisense電極的數(shù)據(jù)不僅驗(yàn)證了HydF雜交體的催化功能，還通過高靈敏度實(shí)時監(jiān)測為人工酶的性能優(yōu)化提供了不可或缺的量化依據(jù)。