An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence

一種孤兒型cbb3型細胞色素氧化酶亞基支持銅綠假單胞菌生物膜生長和毒力

來源：eLife, Volume 6, 2017, Article e30205

《eLife》(《伊萊夫》)，第6卷，2017年，文章編號e30205

 

摘要

這篇論文的摘要討論了缺氧作為細菌在宿主關(guān)聯(lián)中常見的挑戰(zhàn)，特別是在形成密集群落（生物膜）時。cbb3型細胞色素c氧化酶因其高氧親和力而與細菌致病性相關(guān)。假單胞菌不尋常地含有多個完整和部分（即“孤兒”）的cbb3型氧化酶操作子。研究描述了孤兒催化亞基CcoN4在機會致病菌銅綠假單胞菌PA14的菌落生物膜發(fā)育和呼吸中的獨特作用。CcoN4有助于吩嗪（支持生物膜中細胞氧化還原平衡的抗生素）的還原，并在線蟲感染模型中貢獻于毒力。這些結(jié)果強調(diào)了菌落生物膜模型與致病性的相關(guān)性，并突顯了cbb3型氧化酶作為治療靶點的潛力。

 

研究目的

本研究旨在調(diào)查銅綠假單胞菌中多個cbb3型細胞色素氧化酶亞基的功能，特別是孤兒亞基CcoN4在生物膜生長和毒力中的作用。研究目的是確定CcoN4如何緩解缺氧誘導(dǎo)的耐藥性，并支持生物膜環(huán)境中的代謝電子流動，從而提高對銅綠假單胞菌致病機制的理解。

 

研究思路

研究思路包括結(jié)合計算分析、體外實驗和體內(nèi)模型。首先，通過基因組數(shù)據(jù)庫（如EggNOG）分析細菌中cco基因的分布和孤兒亞基的存在。然后，使用銅綠假單胞菌PA14菌株，構(gòu)建一系列基因敲除突變體（如缺失CcoN1、CcoN2、CcoN4等），并在菌落生物膜模型和液體培養(yǎng)中評估這些突變體的表型。通過氧敏感微電極（丹麥Unisense電極）測量生物膜中的氧濃度和氧化還原電位變化，應(yīng)用擴散方程模型計算氧消耗率。同時，進行競爭實驗、基因表達分析和毒力測試（如線蟲感染模型），以驗證CcoN4在生物膜特定環(huán)境中的功能。研究還利用啟動子報告系統(tǒng)分析不同cco操作子的表達模式，從而 linking亞基功能與生物膜微環(huán)境。

 

測量的數(shù)據(jù)及研究意義

1 氧濃度深度剖面數(shù)據(jù)：使用Unisense氧微電極測量生物膜不同深度的氧濃度，生成氧梯度剖面（來自Figure 1D、Figure 3D、Figure 5A）。這些數(shù)據(jù)的研究意義在于量化生物膜內(nèi)的缺氧程度，揭示氧梯度如何影響細胞代謝，并證實CcoN4在緩解缺氧中的作用，為理解生物膜特異性呼吸提供直接證據(jù)。

 

 

 

 

2 生物膜形態(tài)和厚度數(shù)據(jù)：通過菌落形態(tài) assay 和薄層切片測量生物膜高度和結(jié)構(gòu)變化（來自Figure 2A、Figure 3C）。研究意義在于顯示CcoN4缺失導(dǎo)致生物膜形態(tài)異常（如提前皺褶），表明CcoN4對維持生物膜結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要，并關(guān)聯(lián)到氧化還原平衡。

 

3 競爭適應(yīng)度數(shù)據(jù)：通過共培養(yǎng)實驗測量突變體與野生型在生物膜中的生存率（來自Figure 3A、3B）。研究意義在于證明CcoN4缺失突變體在生物膜中處于劣勢，特別是在缺氧區(qū)域，突顯CcoN4在生物膜競爭中的關(guān)鍵角色。

4 氧化還原電位數(shù)據(jù)：使用Unisense鉑微電極測量生物膜深度剖面中的氧化還原電位，評估吩嗪還原活性（來自Figure 5B）。研究意義在于揭示CcoN4參與吩嗪介導(dǎo)的電子傳遞，幫助細胞在缺氧條件下維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，并解釋CcoN4如何減輕缺氧誘導(dǎo)的耐藥性。

5 基因表達數(shù)據(jù)：通過GFP報告系統(tǒng)檢測不同cco操作子在生物膜中的表達模式（來自Figure 4）。研究意義在于顯示ccoN4在生物膜全深度表達，而cco2在缺氧區(qū)誘導(dǎo)，表明亞基功能分區(qū)化，適應(yīng)生物膜微環(huán)境變化。

 

6 毒力數(shù)據(jù)：通過線蟲慢殺模型評估突變體的致病性（來自Figure 6）。研究意義在于證實CcoN4貢獻于銅綠假單胞菌的體內(nèi)毒力， linking生物膜代謝適應(yīng)性與宿主感染結(jié)局。

 

 

 

 

結(jié)論

1 CcoN4孤兒亞基是銅綠假單胞菌生物膜生長和毒力的關(guān)鍵因子，通過支持氧還原和吩嗪介導(dǎo)的電子傳遞來緩解缺氧應(yīng)激。

2 在生物膜環(huán)境中，CcoN4與其它cbb3型氧化酶亞基（如CcoN1和CcoN2）功能冗余，但CcoN4在缺氧條件下作用突出，缺失導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)破壞和適應(yīng)度下降。

3 CcoN4貢獻于吩嗪還原，增強生物膜中氧化還原平衡，其作用獨立于氰化物抗性，突顯了cbb3型氧化酶作為抗菌靶點的潛力。

 

使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義

使用丹麥Unisense電極測量的氧濃度和氧化還原電位數(shù)據(jù)具有關(guān)鍵研究意義，因為這些微電極提供了高時空分辨率的實時量化，能夠精確監(jiān)測生物膜微環(huán)境中的物理化學(xué)變化。Unisense氧電極通過克拉克型傳感器生成與氧濃度成正比的電流，允許測量生物膜深度剖面（如Figure 1D和5A），從而通過擴散模型計算局部氧消耗率，直接評估能量代謝變化。研究意義包括：首先，電極的高靈敏度（可檢測微摩爾級變化）使研究人員能夠識別生物膜中的缺氧梯度，并關(guān)聯(lián)CcoN4功能與氧可用性，證實缺氧是生物膜中心壞死的主要驅(qū)動因素。其次，氧化還原電極測量（如Figure 5B）揭示了吩嗪還原動態(tài)，表明CcoN4參與細胞外電子傳遞，這對于理解生物膜特異性代謝網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要。這些數(shù)據(jù)不僅驗證了計算模型，還為開發(fā)針對缺氧微環(huán)境的療法提供了實證基礎(chǔ)。Unisense電極的應(yīng)用增強了實驗的可靠性，使研究能夠?qū)⑽锢頊y量與生物學(xué)表型直接鏈接，推動了微生物生物膜能量代謝的研究前沿。