Concentration-dependent metabolic effects of metformin in healthy and Fanconi anemia lymphoblast cells

二甲雙胍在健康和范可尼貧血淋巴母細胞中的濃度依賴性代謝效應

來源：Journal of Cellular Physiology, Volume 233, 2017, Pages 1736-1751

《細胞生理學雜志》，第233卷，2017年，第1736-1751頁

 

摘要

這篇論文摘要討論了二甲雙胍（MET）作為一種常用糖尿病藥物，在體外研究中常使用高濃度（10-100倍于患者血漿濃度）的問題。研究評估了不同濃度MET對細胞生化、代謝和形態的影響，并測試了MET對范可尼貧血（FA）細胞和人類早幼粒白血病（HL60）細胞系的作用。發現野生型細胞對MET的反應呈濃度依賴性：低濃度（15和150μM）通過AMPK/Sirt1通路增加氧化磷酸化和氧化應激反應，而高濃度（1.5 mM）抑制呼吸鏈、改變細胞形態并產生毒性。在FA細胞中，MET無法糾正能量/呼吸缺陷，也不改善氧化應激和DNA損傷反應。相反，HL60細胞在150μM時即表現出敏感性。結果強調MET濃度在評估細胞代謝效應中的重要性，并表明使用高濃度MET的體外實驗數據不能直接用于理解臨床效應。

 

研究目的

本研究旨在闡明二甲雙胍（MET）濃度依賴性效應對細胞能量代謝、氧化應激和生化反應通路的影響，使用三個MET濃度（15μM、150μM和1.5 mM），分別對應患者血漿濃度、中間濃度和抑制復合物I的濃度。同時，評估MET對范可尼貧血（FA）細胞（一種存在能量和葡萄糖代謝缺陷的DNA修復遺傳病）和HL60白血病細胞的作用，以探討MET作為潛在治療候選物的可行性。

 

研究思路

研究思路包括使用野生型、FA和FA校正的淋巴母細胞系以及HL60細胞系，進行體外實驗。細胞用不同濃度MET處理24小時后，通過多種技術評估效應：細胞存活和形態使用流式細胞術和電子顯微鏡；能量代謝通過測量ATP/AMP比、葡萄糖消耗、乳酸產生、氧消耗（使用丹麥Unisense電極）、復合物活性和線粒體質量等；氧化應激通過ROS、MDA、GSH和過氧化氫酶活性檢測；信號通路通過Western blot分析AMPK磷酸化和Sirt1表達；DNA損傷通過彗星試驗和染色體斷裂試驗。數據統計處理，比較濃度差異和細胞類型差異。

 

測量的數據及研究意義

1 細胞存活和形態數據：MET在1.5 mM時導致野生型細胞死亡約40%，并引起線粒體腫脹和結構改變（圖1a、1b）。研究意義在于證實高濃度MET的細胞毒性，強調濃度選擇在體外實驗中的臨界性，避免誤導性結論。

 

2 能量代謝數據：低濃度MET增加ATP含量和ATP/AMP比（圖2a），增強PDH活性（圖3a）、復合物I活性（圖3b）、氧消耗（圖3c）和ATP合成（圖3d），但不影響葡萄糖消耗和乳酸產生（圖2b、2c）；高濃度MET抑制有氧代謝，增加糖酵解（圖2b、2c）。研究意義在于揭示MET濃度依賴性雙向調節有氧代謝，低濃度促進線粒體功能，高濃度誘導糖酵解轉換，為MET的代謝調節機制提供實證。

 

 

3 氧化應激數據：低濃度MET增加ROS產生（圖4a）和MDA水平（圖4b），但同時增強過氧化氫酶活性（圖4d）和GSH水平（圖4e）；高濃度MET降低氧化應激但不增強抗氧化防御。研究意義在于表明MET誘導的氧化應激與線粒體活性相關，低濃度觸發適應性抗氧化反應，而高濃度直接抑制電子傳遞鏈，影響氧化還原平衡。

 

4 信號通路數據：低濃度MET激活AMPK磷酸化和增加Sirt1表達（圖5），高濃度僅增加Sirt1表達。研究意義在于確認MET通過AMPK/Sirt1通路調節線粒體生物合成，解釋其濃度依賴性代謝效應。

 

5 DNA穩定性數據：彗星試驗顯示MET處理未增加DNA鏈斷裂（表1），染色體斷裂試驗在FA細胞中無改善（表3）。研究意義在于表明MET在測試濃度下不引起DNA損傷，但在FA細胞中無法糾正固有DNA修復缺陷，提示其治療局限性。

 

 

6 FA細胞特異性數據：MET在FA細胞中雖增加線粒體質量（圖6c），但氧消耗和ATP合成改善有限（圖6e、6f），且不增強抗氧化反應（圖7）。研究意義在于揭示FA細胞線粒體缺陷（復合物I-III異常）削弱MET效益，強調疾病背景對藥物反應的影響。

 

 

 

結論

1 二甲雙胍效應呈濃度依賴性：低濃度（15和150μM）增強有氧代謝和氧化應激反應，通過AMPK/Sirt1通路；高濃度（1.5 mM）抑制呼吸鏈，促進糖酵解，導致細胞毒性。

2 在范可尼貧血細胞中，MET無法有效糾正能量代謝缺陷、氧化應激或DNA損傷反應，因FA細胞存在固有線粒體電子傳遞障礙，限制MET作用。

3 研究強調體外使用高濃度MET的數據不能直接外推至臨床，實際患者血漿濃度（低濃度）更可能通過增強有氧代謝發揮效益，而非抑制效應。

 

使用丹麥Unisense電極測量數據的研究意義

使用丹麥Unisense電極測量的氧消耗數據具有關鍵研究意義，因為它提供了實時、高精度的線粒體呼吸功能定量評估。Unisense電極基于安培法原理，通過檢測封閉腔室中氧分壓變化計算氧消耗率，直接反映細胞有氧代謝活性。在本研究中，電極數據（如圖3c）顯示低濃度MET增加氧消耗，表明增強氧化磷酸化；而高濃度MET抑制氧消耗，證實呼吸鏈抑制。研究意義包括：首先，電極測量提供了客觀的線粒體功能指標，驗證MET濃度依賴性效應，區分促有氧和抑制性作用。其次，通過添加底物（如丙酮酸/蘋果酸或琥珀酸）和抑制劑（如魚藤酮），電極數據可特異性評估電子傳遞鏈不同通路（復合物I-III-IV vs II-III-IV），揭示MET主要影響復合物I途徑。此外，在FA細胞中，電極顯示氧消耗改善有限，突顯線粒體缺陷對藥物反應的干擾。總體而言，Unisense電極的應用增強了實驗的可靠性，為MET代謝調節機制提供了直接生理學證據，支持濃度依賴性結論的嚴謹性。