Minimizing photodecomposition of flavin adenine dinucleotide fluorescence by the use of pulsed LEDs

通過使用脈沖LED最小化黃素腺嘌呤二核苷酸熒光的光分解

來源：Journal of Microscopy, Volume 264, Issue 2, 2016, pages 215-223

《顯微鏡學雜志》，第264卷第2期，2016年，第215-223頁

 

摘要

摘要闡述了動態監測黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）熒光可揭示能量代謝依賴的線粒體氧化還原電位變化，但活組織中的FAD熒光監測受光漂白限制，且光分解會干擾能量代謝和樣本存活。研究利用脈沖LED照明，確定了在海馬腦片中實現最大熒光產額、最低光漂白和代謝干擾的最佳激發設置。通過監測組織氧分壓（pO2）、場電位和細胞外鉀濃度（[K+]o）變化，評估了FAD漂白對能量代謝和存活的影響。結果顯示，脈沖照明（如5 Hz頻率和5 ms脈沖持續時間）顯著降低光漂白，改善組織存活和刺激誘導響應的重現性。

 

研究目的

研究目的是優化FAD熒光監測的照明協議，通過使用脈沖LED最小化光漂白和光分解，從而減少對能量代謝的干擾，提高組織存活率和信號可靠性，為長期活體顯微成像提供可行方案。

 

研究思路

研究思路是在大鼠海馬腦片模型中，使用脈沖LED系統（460 nm）激發FAD熒光，比較不同脈沖頻率（1-50 Hz）和持續時間（1-50 ms）對光漂白的影響。同時，通過同步記錄組織pO2（使用Unisense氧電極）、場電位和[K+]o變化，評估代謝狀態和神經元興奮性。實驗包括短期（5分鐘）和長期（25分鐘）記錄，分析熒光衰減動力學、恢復行為以及刺激誘發響應（如電刺激Schaffer側支誘發的FAD瞬變）。

 

測量的數據及研究意義

1 FAD熒光漂白動力學數據：測量不同脈沖頻率和持續時間下的熒光衰減曲線，包括指數衰減和時間常數。研究意義：確定最佳脈沖參數（5 Hz, 5 ms）以平衡熒光產額和漂白減少，為活體成像提供優化協議。數據來自圖1。

 

2 熒光恢復數據：評估光漂白后的可逆恢復幅度，顯示部分恢復依賴先前照明頻率。研究意義：揭示光分解的不可逆成分和存在非熒光衍生物，有助于理解光損傷機制。數據來自圖2。

 

3 組織pO2變化數據：監測連續和脈沖照明下的基線pO2變化，連續照明導致pO2升高（代謝降低），脈沖照明導致pO2降低（代謝活躍）。研究意義：直接證明光分解干擾線粒體呼吸，脈沖照明保持代謝完整性。數據來自圖3。

 

4 FAD熒光瞬變數據：記錄電刺激誘發的雙相FAD響應（氧化峰和還原谷），比較連續和脈沖照明下的信號穩定性。研究意義：脈沖照明維持信號振幅和重現性，而連續照明導致信號衰減，確保長期記錄可靠性。數據來自圖4。

 

5 神經元興奮性數據：測量場電位振幅、[K+]o上升和pO2衰減響應，脈沖照明下穩定，連續照明下下降。研究意義：表明光分解損害神經元功能，脈沖照明改善組織存活和響應一致性。數據來自圖5。

 

 

 

結論

1 脈沖LED照明（5-10 Hz, 5 ms）顯著降低FAD光漂白和光分解，優于連續照明，提供高熒光產額和 temporal 分辨率。

2 減少光分解改善組織代謝和神經元興奮性，表現為穩定的pO2、場電位和[K+]o響應，確保長期實驗的可靠性。

3 優化協議適用于多種活體準備，為能量代謝研究提供可靠工具，減少成像偽影。

 

使用丹麥Unisense電極測量數據的研究意義

使用丹麥Unisense氧微電極（Clark風格，尖端直徑10μm）測量組織氧分壓（pO2），研究意義在于提供高精度、實時的氧水平量化，直接反映線粒體呼吸和能量代謝狀態。電極通過兩點校準（50%和95% O2飽和aCSF），確保測量準確性。在研究中，pO2數據與FAD熒光同步記錄，顯示連續照明導致pO2升高，表明代謝抑制，而脈沖照明維持pO2下降，證實代謝活躍。這直接證明了FAD光分解通過干擾電子傳遞鏈影響氧消耗，突出了脈沖照明在保護代謝完整性中的關鍵作用。Unisense電極的高靈敏度和穩定性使能量化光損傷對代謝的細微影響，為優化成像協議提供了可靠生理指標。