A Doubling of Microphytobenthos Biomass Coincides with a Tenfold Increase in Denitrifier and Total Bacterial Abundances in Intertidal Sediments of a Temperate Estuary

小底棲植物生物量增加一倍，同時溫帶河口潮間帶沉積物中的反硝化劑和細菌總豐度增加十倍

來源：PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0126583 May 11, 2015

 

一、摘要內容

摘要指出，河口表層沉積物是去除人為無機氮的重要場所。這些沉積物表面常存在微底棲植物（MPB）生物膜，其通過分泌胞外聚合物（EPS）和競爭營養鹽（包括氮）等方式影響下層沉積物中的細菌群落。本研究在荷蘭西斯海爾德河口保利娜潮灘，選取了兩個MPB群落組成相同但生物量（以葉綠素a為指標）相差一倍的沉積物區域進行采樣。通過高通量測序和qPCR分析發現，MPB生物量增加一倍，竟伴隨著總細菌和反硝化菌（含nirS和nirK基因）豐度增加十倍。然而，盡管低豐度類群的群落成員組成存在差異，但總細菌和反硝化菌的群落結構并未發生顯著改變。這表明，在研究的沉積物硝酸鹽濃度下（約1 mg/l），MPB與反硝化菌對硝酸鹽的競爭可忽略不計。研究認為MPB生物量的增加對細菌和反硝化菌豐度有普遍的顯著正面效應。

二、研究目的

本研究旨在檢驗以下四個核心假設：

 

MPB生物量增加不會影響總細菌豐度。

MPB生物量增加會負面影響反硝化菌豐度（因其與MPB競爭硝酸鹽）。

MPB生物量增加會導致不同的總細菌和反硝化菌群落結構。

 

MPB生物量增加會對含nirK和nirS基因的反硝化菌群落產生差異性影響。

 

三、研究思路

研究采用“自然實驗”對比的思路：

 

選址與采樣：在物理化學性質（如總有機質、粒徑、銨鹽濃度等）相似的兩個相鄰區域，選取MPB生物量高（HBM）和低（LBM）的沉積物，確保MPB種類組成相同，從而將觀察到的差異主要歸因于MPB生物量本身。

多組學分析：對沉積物樣本（0-1厘米表層）進行DNA提取，隨后進行：

 

定量分析（qPCR）：測定16S rRNA（總細菌）、nirS和nirK（反硝化菌）基因的絕對豐度。

 

群落結構分析（454焦磷酸測序）：對16S rRNA、nirS和nirK基因進行高通量測序，分析其操作分類單元（OTU）組成、多樣性和結構。

 

環境參數測量：同步測量葉綠素a（MPB生物量代理）、EPS、孔隙水營養鹽（NO??, NO??, NH??, PO?3?, Si）等。關鍵地，使用丹麥Unisense微電極測量沉積物氧氣和pH剖面，以確定氧化-缺氧界面深度和酸堿環境。

 

數據整合：將微生物數據與環境參數進行相關性分析，檢驗初始假設。

 

四、測量數據、研究意義及來源

研究測量了多類數據，其意義和來源如下：

 

沉積物物理化學參數：包括總有機質（TOM）、泥質百分比、孔隙水營養鹽（NO??, NO??, NH??, PO?3?, Si）濃度。數據顯示HBM和LBM區域在這些參數上無顯著差異，但HBM的葉綠素a和EPS顯著更高，PO?3?和Si顯著更低。

 

研究意義：證實了兩個對比區域的主要環境背景相似，差異主要源于MPB活動（高生物量導致更高的EPS和營養鹽吸收）。這為將微生物變化歸因于MPB生物量提供了關鍵前提。

 

數據來源：這些參數匯總于表1。

 

氧氣和pH剖面數據（使用丹麥Unisense電極測量）：使用Unisense微電極（尖端直徑25μm和500μm）測量了沉積物中溶解氧濃度（垂直分辨率0.2毫米）和pH（垂直分辨率1毫米）的垂直分布。

 

研究意義：精確界定了沉積物的氧化還原結構（如氧化層深度）。數據顯示HBM和LBM的氧化-缺氧界面深度和pH幾何均值相似，進一步支持了二者氧化還原環境的可比性，排除了氧氣梯度作為主要驅動因素的可能性。

 

數據來源：該方法在“材料與方法”部分的“Sediment sampling and physico-chemical analysis”段落中描述，測量結果在表1中以文本形式報告（pH和氧化-缺氧界面深度）。

 

總細菌和反硝化菌基因絕對豐度數據（qPCR）：測量了16S rRNA、nirS和nirK基因的拷貝數/克沉積物。

 

研究意義：這是驗證假設1和2的核心證據。結果顯示HBM沉積物中三種基因的豐度均比LBM高出約一個數量級（十倍），直接推翻了假設1和2，表明MPB生物量增加極大地促進了總細菌和反硝化菌的生長。

 

數據來源：這些絕對豐度數據詳細展示在表5中。

 

微生物群落OTU豐富度、多樣性和結構數據（高通量測序）：通過測序獲得了16S rRNA、nirS和nirK基因的OTU信息，計算了豐富度（如Chao1）、多樣性（如Inverse Simpson）指數，并分析了群落結構（Bray-Curtis相異指數）和成員組成（Jaccard相異指數）。

 

研究意義：用于檢驗假設3和4。結果顯示，盡管HBM的OTU豐富度顯著低于LBM，且非優勢類群的成員組成存在差異，但總細菌、nirS和nirK群落的整體結構（Bray-Curtis）在HBM和LBM間均無顯著差異。這表明MPB生物量增加并未導致群落結構重組。

 

 

 

 

 

數據來源：豐富度和多樣性指數匯總于表2。群落成員和結構的相異指數分析結果展示在表3。OTU的分布通過圖2（16S rRNA）和圖4（nirK, nirS）的韋恩圖展示。

 

特定細菌類群的相對豐度變化數據：分析了與硅藻相關的細菌類群以及其他在HBM中顯著增加的細菌類群。

 

研究意義：揭示了MPB生物量增加可能對特定細菌類群有促進或抑制作用，例如假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對豐度在HBM中增加超過30%。這說明了MPB對細菌群落存在分類學上的特異性影響。

 

數據來源：此類分析在結果部分“Taxonomic diversity in HBM and LBM samples”和討論中提及，相關數據可參考圖3和支持信息S4表。

 

五、結論

研究得出以下核心結論：

 

顯著促進微生物豐度：MPB生物量增加一倍，對下層沉積物中的總細菌和反硝化菌豐度產生了不成比例的、十倍的增長效應。

未改變群落結構：盡管微生物豐度急劇增加，且非優勢類群的成員組成存在差異，但總細菌、nirS和nirK反硝化菌的群落整體結構并未發生顯著改變。

無營養競爭證據：反硝化菌豐度隨MPB生物量同步增加，表明在研究的硝酸鹽濃度下（~1 mg/l），MPB與反硝化菌之間對硝酸鹽的競爭可以忽略不計。MPB更像是細菌群落的普遍促進者。

 

環境相關性：細菌和反硝化菌豐度與葉綠素a、EPS呈顯著正相關，與Si濃度呈負相關，進一步將微生物動態與MPB活動聯系起來。

 

六、使用丹麥Unisense電極測量數據的研究意義詳細解讀

在本研究中，使用丹麥Unisense公司生產的微電極測量的氧氣和pH剖面數據，雖然數值本身（如氧化層深度~5-6.5毫米）并未在HBM和LBM間顯示出顯著差異，但其研究意義至關重要，主要體現在以下幾個方面：

 

提供了關鍵的實驗控制證據：本研究的核心是分離出“MPB生物量”這一單一變量的影響。Unisense微電極提供的高分辨率環境剖面數據，確鑿地證明了HBM和LBM沉積物在關鍵的氧化還原條件（氧氣滲透深度）和酸堿度（pH）上是相似的。這排除了這些基礎物理化學梯度差異是導致微生物豐度和群落差異的主要驅動力的可能性，從而強有力地支持了論文的核心論點——即觀察到的微生物變化確實主要是由MPB生物量的差異引起的。

界定了微生物活動的化學環境：沉積物中的氧氣分布直接控制著好氧與厭氧代謝過程的空間分異。Unisense數據表明，兩個區域的微生物群落都是在相似的氧化還原界面附近活動。這對于理解反硝化過程（主要發生在缺氧區）尤其重要。穩定的氧化層深度說明，MPB生物量增加并未通過顯著改變氧氣供應來間接影響微生物，其影響更可能是通過提供有機質（如EPS）實現的。

 

體現了方法學的嚴謹性：Unisense微電極能夠進行原位、高空間分辨率（亞毫米級）的測量，避免了傳統取樣方法可能帶來的擾動和氧化，獲得了更真實可靠的沉積物微環境數據。這種精確的環境表征為整個微生物分子生物學分析（qPCR和測序）提供了一個可靠和可信的環境背景框架。

 

總而言之，Unisense電極數據在本研究中扮演了 “環境背景驗證者”的角色。它的價值不在于顯示出處理組與對照組的差異，而恰恰在于證明了除目標變量（MPB生物量）外，其他關鍵環境因素在兩組間是基本一致的。這使得后續觀察到的十倍微生物豐度差異能夠更有力地歸因于MPB生物量本身，極大地增強了整個實驗結論的可靠性和說服力。