3.6 H2-MBs減少心肌炎癥和氧化應(yīng)激損傷。

使用ELISA分析檢測(cè)了缺血30分鐘和再灌注24小時(shí)后產(chǎn)生的關(guān)鍵促炎和氧化應(yīng)激細(xì)胞因子。結(jié)果顯示，接受載體處理的大鼠的所有檢測(cè)到的細(xì)胞因子均顯著增加，與假動(dòng)物相比（P<0.05）。相比之下，接受H2-MB處理的大鼠顯示出不同程度的減少心肌炎癥和氧化損傷。與接受載體處理的動(dòng)物相比，接受H2-MBs的大鼠的MPO減少了28.0％（P<0.05）（圖6a），心肌裂解物中TNF-α和IL-1β水平的評(píng)估顯示H2-MB處理的大鼠分別減少了39.0％和14.5％與接受載體處理的組相比（P<0.01）（圖6b，c）。此外，心肌組織勻漿中的前氧化細(xì)胞因子ELISA分析顯示，接受H2-MBs的大鼠的8-OHdG水平顯著降低，與接受載體處理的動(dòng)物相比（115.78±10.88 vs 88.31±6.34 ng/mg蛋白）（P<0.01）（圖6d）。H2-MB處理組中心肌組織中的MDA水平顯示出類(lèi)似的變化，比載體處理組低12.16％（P<0.05）（圖6e）。

圖6.心肌促炎和促氧化細(xì)胞因子以及ROS的ELISA分析。從接受假手術(shù)處理、車(chē)輛處理或H2-MB處理的大鼠獲得心臟組織勻漿，這些大鼠經(jīng)歷了30分鐘的缺血和24小時(shí)的再灌注，以分析產(chǎn)生的心肌促炎和促氧化細(xì)胞因子。為了檢測(cè)ROS，在經(jīng)歷30分鐘缺血后，大鼠在再灌注40分鐘前靜脈注射了載體或H2-MBs。所有檢測(cè)的心肌促炎和促氧化細(xì)胞因子的水平在心肌缺血再灌注后均增加，但在大鼠接受H2-MBs后，這些水平以不同程度降低。(a?c)然后檢測(cè)了包括MPO、TNF-α和IL-1β在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子水平（n=6）。*P<0.05，**P<0.01。數(shù)據(jù)表示平均值±s.d。(d,e)檢測(cè)了促氧化劑8-OHdG和MDA細(xì)胞因子的水平（n=6）。*P<0.05，**P<0.01。數(shù)據(jù)表示平均值±s.d。(f?i)通過(guò)測(cè)量它們與HPF、DAF-2、NBT或CM-H2DCFDA的反應(yīng)性來(lái)檢測(cè)勻漿中自由基（?OH、NO?、O2??）和H2O2的水平。使用自動(dòng)微板讀數(shù)器測(cè)定熒光強(qiáng)度，具體描述見(jiàn)方法部分（n=3）。*P<0.05，**P<0.01。數(shù)據(jù)表示平均值±s.d.

3.7 H2-MBs選擇性減少羥自由基。

其他研究表明，H2可以選擇性地減少細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞毒氧自由基并中和羥自由基（?OH）。因此，我們進(jìn)一步研究了H2-MBs是否能夠有效減少缺血30分鐘和再灌注40分鐘后心肌組織AAR中的ROS。與接受載體處理的大鼠相比，H2-MB處理的大鼠在40分鐘再灌注后顯示出羥自由基水平顯著降低（P<0.05）（圖6f）；然而，心肌裂解物中NO?、O2??和H2O2水平的評(píng)估顯示所有組之間沒(méi)有差異（P>0.05）。

3.8 H2-MBs具有良好的生物相容性。

進(jìn)行了毒理學(xué)分析，以檢測(cè)H2-MBs是否對(duì)健康大鼠有毒。血液分析，包括完全血細(xì)胞計(jì)數(shù)，表明靜脈注射H2-MBs后3或7天的血細(xì)胞計(jì)數(shù)值均在正常范圍內(nèi)（表S2）。此外，還對(duì)心臟、脾臟、肝臟、肺臟和腎臟進(jìn)行了組織學(xué)檢查，結(jié)果顯示H2-MBs對(duì)這些器官?zèng)]有產(chǎn)生不良影響（圖S7）。此外，注射H2-MBs的大鼠未觀察到異常行為，表明H2-MBs具有良好的生物相容性，對(duì)大鼠無(wú)毒。

4討論

目前，尚無(wú)可用于預(yù)防心血管疾病的圖像引導(dǎo)型H2輸送系統(tǒng)。在本研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了H2-MBs用于超聲引導(dǎo)的治療性H2輸送系統(tǒng)，以促進(jìn)治療載體實(shí)時(shí)和可視化地輸送到心肌組織。該輸送系統(tǒng)有望為將治療性氣體治療從基礎(chǔ)科學(xué)轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

在我們當(dāng)前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用MBs封裝H2時(shí)，每單位體積溶液中的H2含量更高（C3F8/H2=1:1時(shí)大約高出3倍）比使用H2飽和的生理鹽水（在0.4 MPa壓力下溶解H2）時(shí)，這意味著H2-MBs可以大大提高單位體積溶液中的H2溶解度。這種方法有潛力通過(guò)增加H2-MBs的數(shù)量而不是增加壓力或體積來(lái)輕松實(shí)現(xiàn)有限體積溶液中的更高H2濃度。此外，在我們的體外和體內(nèi)研究中，我們發(fā)現(xiàn)H2-MBs可以有效釋放H2，在PBS中的最大H2水平為180±0.02μmol/L，在大鼠動(dòng)脈血中為119±0.02μmol/L。值得注意的是，這幾乎是之前研究中觀察到的氫氣濃度的6到10倍，那些研究中大鼠被迫吸入氫氣。在他們的研究中，證據(jù)表明氫通過(guò)選擇性減少細(xì)胞毒氧自由基直接影響氧化劑，而每毫升動(dòng)脈血中的20ng H2（相當(dāng)于10μmol/L濃度）被認(rèn)為是有效的治療劑量。

超聲成像的數(shù)據(jù)表明H2-MBs可以在聲學(xué)激發(fā)下用于成像。MBs的這種獨(dú)特聲學(xué)特性有助于實(shí)時(shí)跟蹤H2輸送到心肌組織并監(jiān)測(cè)治療氣體的劑量，因?yàn)槌曅盘?hào)強(qiáng)度與H2-MBs的濃度成正比。到目前為止，尚未有關(guān)于使用H2的圖像引導(dǎo)型輸送系統(tǒng)用于治療應(yīng)用的報(bào)告。此外，我們的體外和體內(nèi)成像分析一致表明H2-MBs的濃度與超聲信號(hào)強(qiáng)度成正比（圖2）。

來(lái)自心肌梗死面積評(píng)估和超聲心動(dòng)圖的數(shù)據(jù)表明，H2-MBs可以有效保護(hù)免受心肌缺血再灌注損傷，從而保護(hù)LV功能。然后，我們?cè)u(píng)估了心肌梗死后H2-MBs對(duì)心肌細(xì)胞凋亡和炎癥的影響。組織學(xué)分析顯示，在接受H2-MBs的大鼠的缺血區(qū)域內(nèi)，出血和凋亡顯著減少，以及caspase-3的表達(dá)減少。此外，對(duì)炎癥細(xì)胞因子的定量分析顯示，與接受載體處理的大鼠相比，接受H2-MBs處理的大鼠的心肌中MPO、TNF-α和IL-1β水平顯著降低。事實(shí)上，通過(guò)H2的抗炎作用啟動(dòng)心臟保護(hù)已有先前報(bào)道。此外，我們的數(shù)據(jù)顯示，H2-MBs的給藥減少了“潛在”梗死區(qū)域中8-OHdG和MDA的水平，這表明H2-MBs的抗氧化作用，至少部分地，是通過(guò)ROS清除作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。對(duì)ROS的進(jìn)一步分析證實(shí)了H2-MBs中和有毒ROS的能力。然而，在心肌缺血再灌注損傷后，接受H2-MBs的大鼠心肌組織中的?OH水平下降，而NO?、O2??或過(guò)氧化氫（H2O2）的水平?jīng)]有變化。這些結(jié)果與先前的研究相符。在生物系統(tǒng)中，羥自由基是ROS中最具反應(yīng)性的產(chǎn)物，通過(guò)Haber-Weiss反應(yīng)從過(guò)氧化物陰離子生成，或通過(guò)Fenton反應(yīng)從H2O2生成。因此，開(kāi)發(fā)的智能H2-MBs作為一個(gè)平臺(tái)，具有在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中作為安全有效的抗氧化劑，并具有最小副作用的前景。

5結(jié)論

總的來(lái)說(shuō)，我們開(kāi)發(fā)了一種新穎的、圖像引導(dǎo)的治療性H2輸送系統(tǒng)，簡(jiǎn)單易用，由此產(chǎn)生的H2-MBs極大地提高了單位體積溶液中的H2溶解度。更重要的是，H2-MBs可以被視覺(jué)跟蹤，并用于保護(hù)心肌缺血再灌注損傷。我們的研究為基于H2的治療應(yīng)用的臨床轉(zhuǎn)化提供了潛在解決方案。