硫化氫（硫化氫）在多種哺乳動物組織中自然合成。硫化氫是否參與調(diào)控紅細(xì)胞功能仍不清楚。通過使用硫化氫自然合成酶胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）基因缺陷的小鼠和高通量代謝組學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)，在常氧條件下，CSE敲除（Cse-/-）小鼠的紅細(xì)胞中2,3-雙磷酸甘油酸（2,3-BPG）水平升高，這是一種紅系特異性代謝物，可負(fù)向調(diào)節(jié)血紅蛋白（Hb）與氧（O2）的結(jié)合親和力。一致地，Cse-/-小鼠紅細(xì)胞的50%氧飽和度（P50）值升高。這些效應(yīng)可通過硫化氫供體GYY4137處理逆轉(zhuǎn)。在培養(yǎng)的小鼠和人類紅細(xì)胞模型中，我們發(fā)現(xiàn)硫化氫直接作用于紅細(xì)胞，減少2,3-BPG的生成，從而增強(qiáng)Hb-O2結(jié)合親和力。小鼠遺傳學(xué)研究表明，外周組織產(chǎn)生的硫化氫對2,3-BPG生成具有持續(xù)抑制作用，從而維持紅細(xì)胞中Hb-O2結(jié)合親和力。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，硫化氫促進(jìn)Hb從膜釋放到細(xì)胞質(zhì)，并增強(qiáng)雙磷酸甘油酸變位酶（BPGM）與膜的錨定。這些過程可能與Hb的S-硫水合有關(guān)。此外，低氧可降低小鼠循環(huán)中的硫化氫水平并增加紅細(xì)胞2,3-BPG含量，而GYY4137處理可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。總體而言，我們的研究揭示了一種調(diào)節(jié)紅細(xì)胞攜氧能力的新型信號通路，并突顯了硫化氫在紅細(xì)胞2,3-BPG生成中一個先前未被認(rèn)識的作用。

1.引言

紅細(xì)胞（RBCs）作為血液中最豐富的血細(xì)胞類型，約占人體總細(xì)胞數(shù)的75%。紅細(xì)胞的主要功能是作為攜氧者，在呼吸系統(tǒng)與代謝組織之間運輸氧氣，因為紅細(xì)胞具有高濃度的血紅蛋白作為攜氧物質(zhì)。在肺部，氧氣從吸入的空氣中穿過肺泡屏障擴(kuò)散進(jìn)入血液，其中大部分與血紅蛋白（Hb）結(jié)合形成氧合血紅蛋白（oxy-Hb）。在外周組織中，氧合血紅蛋白釋放氧氣（脫氧）并擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。

傳統(tǒng)上，血紅蛋白結(jié)合和釋放氧氣的能力取決于局部氧分壓。血紅蛋白與氧的親和力與氧分壓之間的關(guān)系可描述為血紅蛋白-氧解離曲線。紅細(xì)胞通過內(nèi)源性變構(gòu)調(diào)節(jié)因子（包括H+、二氧化碳、2,3-二磷酸甘油酸（2,3-BPG）、Cl-和乳酸離子）對血紅蛋白-氧親和力進(jìn)行復(fù)雜調(diào)控，從而功能性地調(diào)節(jié)O2攝取、運輸和遞送。這些因子在紅細(xì)胞中的濃度會因細(xì)胞代謝和細(xì)胞外環(huán)境變化而波動，導(dǎo)致血紅蛋白-氧親和力的調(diào)整，這種調(diào)整可能有助于優(yōu)化組織供氧。

硫化氫（H?S）被稱為“第三種內(nèi)源性氣體信號傳遞物”，因為它是在一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后被發(fā)現(xiàn)的。L-半胱氨酸合成的H?S在哺乳動物組織中廣泛存在，主要通過胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）、胱硫醚-β-合成酶（CBS）和3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（3-MST）等酶的活性實現(xiàn)。H?S參與多種生理和病理過程，如血管舒張、血管生成和炎癥。此外，H?S在多種損傷刺激下（如缺氧和缺血再灌注）作為各種組織的重要保護(hù)因子發(fā)揮作用。多項研究表明，紅細(xì)胞能夠產(chǎn)生H?S，因為在紅細(xì)胞中檢測到了H?S生成酶的活性。有趣的是，D‘Alessandro等人最近報告稱，暴露于高海拔缺氧環(huán)境的健康志愿者紅細(xì)胞中H?S的產(chǎn)生減少。因此，我們假設(shè)H?S在紅細(xì)胞中具有功能作用。為驗證這一假設(shè)，我們進(jìn)行了代謝組學(xué)分析、小鼠遺傳學(xué)和骨髓移植實驗，結(jié)合體外人和小鼠紅細(xì)胞培養(yǎng)以及體內(nèi)缺氧挑戰(zhàn)小鼠研究。我們首次證明，H?S通過調(diào)控2,3-BPG的生成，是紅細(xì)胞Hb-O?親和力的重要調(diào)節(jié)因子。此外，我們闡明硫化氫促進(jìn)血紅蛋白從膜釋放到細(xì)胞質(zhì)，并因此增強(qiáng)雙磷酸甘油酸變位酶（BPGM）錨定于膜，從而減少2,3-BPG的生成。此外，我們還發(fā)現(xiàn)硫化氫增強(qiáng)血紅蛋白從膜釋放的過程可能與Hb的S-硫水合有關(guān)。綜上所述，本研究通過揭示一條調(diào)控氧氣運輸?shù)男滦盘柾罚⒔沂玖蚧瘹湓诩t細(xì)胞2,3-BPG生成中先前未被認(rèn)識的作用，為紅細(xì)胞生理學(xué)提供了新的見解。

2.材料與方法

2.1動物實驗流程

成年C57BL/6J野生型（WT）小鼠購自上海實驗動物公司（中國上海）。C57BL/6J背景的CSE缺陷型（Cse-/-）小鼠由上海生物模型生物有限公司提供，實驗小鼠以3-5只為一組飼養(yǎng)于籠舍中，保持12小時晝夜節(jié)律，環(huán)境溫度控制在22±2℃，濕度50±10%，提供標(biāo)準(zhǔn)飼料和自由飲水。實驗共分三組進(jìn)行：第一組實驗中，8-10周齡的成年雄性WT和Cse-/-小鼠隨機(jī)分為兩組，分別腹腔注射GYY4137（133μmol/kg）或等量生理鹽水作為對照。處理24小時后處死動物并采集血液及組織樣本；第二組實驗中，WT和Cse-/-小鼠同樣隨機(jī)分組，分別腹腔注射匹那西地（2.8μmol/kg）或等量生理鹽水作為對照，處理24小時后處死并采集樣本；第三組實驗中，WT小鼠隨機(jī)分為五組，其中兩組分別在常壓缺氧條件下持續(xù)24小時和72小時，另一組作為對照組置于常氧環(huán)境中。兩組小鼠分別接受常壓缺氧條件處理1天，分別使用溶劑和GYY4137（133μmol/kg）進(jìn)行治療。在缺氧處理組中，小鼠被置于缺氧箱（10%O2和90%N2）內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)飲食和水自由攝取。GYY4137和pinacidil購自Sigma-Aldrich，并溶解于生理鹽水中。GYY4137和pinacidil的劑量選擇基于文獻(xiàn)和我們的初步研究。所有涉及動物實驗的方案均經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)動物護(hù)理與使用委員會審查批準(zhǔn)。

2.2.輻照與骨髓移植（BMT）

本研究中進(jìn)行了野生型（WT）與Cse-/-小鼠之間的相互骨髓移植。在輻照前，4至6周齡的受體小鼠用100μg/ml新霉素和10μg/ml多粘菌素B硫酸鹽處理酸化飲用水（pH 2.7）1周，如先前文獻(xiàn)所述并稍作修改。隨后，使用鈷源伽馬輻照儀（第二軍醫(yī)大學(xué)輻照中心）以70 cGy/min的速率對小鼠進(jìn)行9.0 Gy致死性輻照。從供體小鼠股骨中分離骨髓細(xì)胞（BMCs），并通過尾靜脈注射（每只小鼠1×10?BMCs）轉(zhuǎn)移至輻照受體小鼠體內(nèi)。骨髓移植后，小鼠繼續(xù)飲用含100μg/ml新霉素和10μg/ml多粘菌素B硫酸鹽的飲用水2周。小鼠飼養(yǎng)至少8周后，通過檢測受體小鼠白細(xì)胞中的CSE mRNA水平作為嵌合體指標(biāo)。

2.3人類受試者

健康志愿者的血液樣本采集已獲得第二軍醫(yī)大學(xué)（SMMU）生物醫(yī)學(xué)研究倫理專業(yè)委員會批準(zhǔn)。在向志愿者詳細(xì)說明研究方案后，獲得其書面知情同意。受試者年齡在28-32歲之間，均為男性，無吸煙史，且無心血管、呼吸系統(tǒng)、腎臟及肝臟疾病。