研究表明，KATP通道開放劑如pinacidil可降低Cse-/--小鼠的血壓。為了確定Cse-/--小鼠中2,3-BPG生成和Hb-O2親和力的變化是否與高血壓相關(guān)，我們檢測(cè)了pinacidil處理對(duì)Cse-/--小鼠紅細(xì)胞中2,3-BPG生成和P50的影響。如圖2(d)–2(f)所示，pinacidil處理顯著降低了Cse-/--小鼠的血壓，但未影響其紅細(xì)胞中2,3-BPG的生成和Hb-O2親和力。上述數(shù)據(jù)表明，Cse-/--小鼠中2,3-BPG和P50水平的升高與高血壓無關(guān)。接下來，我們測(cè)試了硫化氫對(duì)野生型小鼠和人類紅細(xì)胞中2,3-BPG生成及血紅蛋白氧親和力的直接影響。如圖3(a)-3(c)所示，用硫化氫供體GYY4137（500μM）處理分離的小鼠紅細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的2,3-BPG濃度降低，氧解離曲線左移，P50水平下降。在分離的人類紅細(xì)胞中也觀察到GYY4137對(duì)2,3-BPG生成和P50水平的類似影響（圖3(d)-3(f)）。此外，我們發(fā)現(xiàn)GYY4137處理對(duì)小鼠和人類血紅蛋白的P50水平無顯著影響。上述數(shù)據(jù)表明，硫化氫通過作用于紅細(xì)胞而非血紅蛋白來降低2,3-BPG生成，從而增強(qiáng)血紅蛋白-氧親和力。

圖3：硫化氫對(duì)培養(yǎng)紅細(xì)胞中2,3-BPG濃度和Hb-O2親和力的影響。（a–c）分離的小鼠紅細(xì)胞經(jīng)指定劑量的GYY4137處理6小時(shí)后收集，用于測(cè)定2,3-BPG水平(a)和氧解離曲線（(b)P50值；(c)氧解離曲線的代表性軌跡）。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n=6個(gè)培養(yǎng)物）。（d–f）人紅細(xì)胞經(jīng)GYY4137處理6小時(shí)后收集，用于測(cè)定2,3-BPG水平(d)和氧解離曲線（(e)P50值；(f)氧解離曲線的代表性軌跡）。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n=6個(gè)培養(yǎng)物）。

3.2硫化氫通過抑制膜錨定的 BPGM 從膜到細(xì)胞質(zhì)的釋放來抑制紅細(xì)胞2,3- BPG 的產(chǎn)生

硫化氫通過抑制膜錨定的BPGM從膜向細(xì)胞質(zhì)的釋放來抑制紅細(xì)胞2,3-BPG生成。BPGM是紅細(xì)胞中2,3-BPG生成的關(guān)鍵限速酶。在紅細(xì)胞中，糖酵解酶在膜與細(xì)胞質(zhì)之間的轉(zhuǎn)運(yùn)是調(diào)控細(xì)胞質(zhì)糖酵解酶活性的關(guān)鍵機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，Cse-/-小鼠的細(xì)胞質(zhì)中BPGM活性增加（圖4(a)）。與此一致的是，Cse-/-小鼠的細(xì)胞質(zhì)中BPGM蛋白水平也顯著升高，而膜中BPGM蛋白水平顯著降低（圖4(b)）。免疫熒光分析還顯示BPGM從細(xì)胞膜向在Cse-/-小鼠紅細(xì)胞的胞質(zhì)中（圖4(c)），GYY4137處理顯著降低了胞質(zhì)BPGM的活性和蛋白水平，同時(shí)提高了Cse-/-小鼠細(xì)胞膜上的BPGM含量（圖4(a)和4(b)），并誘導(dǎo)BPGM在Cse-/-小鼠紅細(xì)胞膜上發(fā)生錨定（圖4(c)）。在小鼠（圖5(a)和5(b)）及人類（圖5(c)和5(d)）紅細(xì)胞培養(yǎng)模型中，GYY4137同樣表現(xiàn)出抑制胞質(zhì)BPGM活性、提升膜上BPGM水平、降低胞質(zhì)BPGM水平的特性。圖像分析證實(shí)，GYY4137可誘導(dǎo)BPGM從胞質(zhì)向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位（圖5(e)）。

圖4：硫化氫對(duì)紅細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)間BPGM轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。野生型（WT）和Cse-/-小鼠分別給予生理鹽水或GYY4137（50 mg/kg）。處理24小時(shí)后采集血樣。分離紅細(xì)胞以測(cè)定胞質(zhì)BPGM活性及膜與胞質(zhì)BPGM水平，并進(jìn)行BPGM免疫熒光染色。(a)WT和Cse-/-小鼠紅細(xì)胞胞質(zhì)BPGM活性（有無GYY4137處理）。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n=10）。(b)WT和Cse-/-小鼠紅細(xì)胞膜與胞質(zhì)BPGM水平（有無GYY4137處理）。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n=6）。(c)WT和Cse-/-小鼠紅細(xì)胞BPGM染色代表性圖像（有無GYY4137處理）。***p<0.001，*****p<0.0001

圖5：硫化氫對(duì)培養(yǎng)紅細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)間BPGM轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。紅細(xì)胞分別從野生型小鼠（a、b、e）和健康志愿者（c、d、e）中分離，并與指定劑量的GYY4137共同孵育6小時(shí)。收集細(xì)胞以測(cè)定胞質(zhì)BPGM活性、膜與胞質(zhì)BPGM水平，并進(jìn)行BPGM免疫熒光染色。（a、c）小鼠(a)和人(c)紅細(xì)胞經(jīng)GYY4137處理前后胞質(zhì)BPGM活性。（b、d）小鼠(b)和人(d)紅細(xì)胞經(jīng)GYY4137處理前后膜與胞質(zhì)BPGM水平。(e)小鼠和人紅細(xì)胞經(jīng)GYY4137處理前后染色的代表性圖像。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n=6個(gè)培養(yǎng)物）。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

3.3.硫化氫降低血紅蛋白與膜的錨定，從而減少BPGM從膜的釋放。

已有研究表明，糖酵解酶在膜與細(xì)胞質(zhì)之間的轉(zhuǎn)運(yùn)歸因于血紅蛋白在膜與細(xì)胞質(zhì)之間的運(yùn)輸。血紅蛋白可結(jié)合膜上的帶3細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域并取代糖酵解酶，這些分子隨后重新定位到細(xì)胞質(zhì)中。因此我們假設(shè)，H2S誘導(dǎo)的BPGM與膜的錨定歸因于膜錨定血紅蛋白的減少。為驗(yàn)證這一假設(shè)，我們首先探究了BPGM是否與紅細(xì)胞膜蛋白相互作用。質(zhì)譜分析顯示，α-和β-譜蛋白、錨蛋白及帶4.2蛋白是與BPGM相互作用的潛在蛋白。有趣的是，在紅細(xì)胞膜中，帶3蛋白可與多種蛋白相互作用，包括帶4.2、錨蛋白和譜蛋白，從而構(gòu)成稱為帶3巨復(fù)合體的單一復(fù)合物。通過共免疫沉淀法，我們驗(yàn)證了BPGM可與帶4.2相互作用，并確認(rèn)血紅蛋白與帶4.2相互作用（圖6(a)）。

圖6：硫化氫對(duì)紅細(xì)胞中Hb和BPGM與膜蛋白相互作用及Hb轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。(a)Hb和BPGM與band 4.2蛋白的相互作用。在小鼠紅細(xì)胞裂解液中進(jìn)行band 4.2抗體共免疫沉淀。通過Western blot分析檢測(cè)免疫沉淀物中的BPGM和Hb。(b)硫化氫對(duì)體內(nèi)Hb在膜與細(xì)胞質(zhì)間轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。野生型和Cse-/-小鼠分別給予生理鹽水或GYY4137（50 mg/kg）。處理24小時(shí)后收集紅細(xì)胞以測(cè)定膜血紅素濃度。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n=10）。（c，d）硫化氫對(duì)培養(yǎng)紅細(xì)胞中Hb在膜與細(xì)胞質(zhì)間轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。分離的小鼠(c)或人(d)紅細(xì)胞經(jīng)指定劑量GYY4137處理6小時(shí)后收集，以測(cè)定膜血紅素濃度。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n=6個(gè)培養(yǎng)物）。(e)代表性圖像顯示硫化氫對(duì)Hb和BPGM與band 4.2蛋白相互作用的影響。野生型和Cse-/-小鼠分別注射生理鹽水或GYY4137（50 mg/kg）。處理24小時(shí)后采集血液樣本。分離紅細(xì)胞進(jìn)行共免疫沉淀分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

因此，這可能表明血紅蛋白和BPGM通過與帶3巨復(fù)合體相互作用而錨定于膜。其次，我們通過測(cè)量紅細(xì)胞膜中的血紅素含量來確定膜錨定血紅蛋白。根據(jù)Cse-/-小鼠中BPGM從細(xì)胞膜釋放的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Cse-/-小鼠紅細(xì)胞的膜血紅素含量顯著升高，但經(jīng)GYY4137處理后該現(xiàn)象得到逆轉(zhuǎn)（圖6(b)）。在小鼠和人類紅細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，GYY4137處理同樣降低了膜血紅素含量（圖6(c)和6(d)）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Cse-/-小鼠紅細(xì)胞中，帶4.2蛋白與血紅蛋白（Hb）的結(jié)合量增加，而與BPGM的結(jié)合量減少。GYY4137處理后，帶4.2蛋白與Hb的結(jié)合量下降，同時(shí)與BPGM的結(jié)合量有所增加。

在Cse-/-小鼠的紅細(xì)胞中，硫化氫與BPGM結(jié)合（圖6(e)），表明帶4.2與BPGM的結(jié)合以及帶4.2與Hb的結(jié)合是相互關(guān)聯(lián)的，且硫化氫對(duì)Hb和BPGM與帶3大復(fù)合體的結(jié)合有影響。血影膜實(shí)驗(yàn)顯示，GYY4137減少了小鼠（圖7(a)和7(b)）和人類（圖7(c)和7(d)）紅細(xì)胞血影膜制備中膜的血紅素含量和上清液中的BPGM活性。因此，我們提供了證據(jù)表明，BPGM從膜的釋放與Hb錨定到膜有關(guān)，并且硫化氫負(fù)向調(diào)節(jié)這一過程。

3.4 硫化氫抑制Hb錨定到膜可能與Hb的S-硫水合作用有關(guān)。

S-硫水合作用已被認(rèn)為是真核細(xì)胞中硫化氫的一種新型翻譯后修飾。S-硫水合作用的抑制劑異乙酰胺（IAM）逆轉(zhuǎn)了GYY4137誘導(dǎo)的膜中血紅素含量和細(xì)胞質(zhì)中BPGM活性的減少（圖7(a)–7(d)），表明S-硫水合作用可能是H2S介導(dǎo)的Hb和BPGM在膜與細(xì)胞質(zhì)之間的轉(zhuǎn)運(yùn)的基礎(chǔ)。接下來，我們打算通過馬來酰亞胺實(shí)驗(yàn)結(jié)合質(zhì)譜分析來鑒定硫化氫在紅細(xì)胞中硫水合的蛋白質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)Hb是小鼠紅細(xì)胞中S-硫水合蛋白質(zhì)中最豐富的蛋白質(zhì)。如圖7(e)所示，與野生型小鼠相比，Cse-/-小鼠紅細(xì)胞中Hb的S-硫水合作用較少。給予GYY4137可使Cse-/-和野生型小鼠的血紅蛋白（Hb）發(fā)生S-硫水合。在培養(yǎng)的人類紅細(xì)胞中，GYY4137處理同樣增強(qiáng)了Hb的S-硫水合（圖7(g)）。然而，在野生型和Cse-/-小鼠的紅細(xì)胞中，無論是否使用GYY4137處理，均未觀察到明顯的BPGM S-硫水合現(xiàn)象（圖7(f)）。在培養(yǎng)的人類紅細(xì)胞中，無論是否使用GYY4137，均未出現(xiàn)明顯的BPGM S-硫水合（圖7(h)）。隨后我們?cè)噲D確定Hb的S-硫水合位點(diǎn)。質(zhì)譜分析顯示，在小鼠紅細(xì)胞中，Hbα鏈第104位半胱氨酸的單一位點(diǎn)發(fā)生S-硫水合。而在人類紅細(xì)胞中，Hbα鏈第105位半胱氨酸發(fā)生S-硫水合。

圖7：硫化氫對(duì)Hb和BPGM轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)作用及S-硫水合在這些過程中的作用。（a–d）硫化氫和碘乙酰胺對(duì)小鼠和人紅細(xì)胞鬼膜中Hb與膜結(jié)合及BPGM從膜釋放的影響。小鼠紅細(xì)胞膜鬼膜經(jīng)Hb和不同濃度的GYY4137處理（存在或不存在碘乙酰胺（IAM））后，Hb與膜結(jié)合(a)和BPGM從膜釋放到細(xì)胞質(zhì)(b)。人紅細(xì)胞膜鬼膜經(jīng)Hb和不同濃度的GYY4137處理（存在或不存在碘乙酰胺（IAM））后，Hb與膜結(jié)合(c)和BPGM從膜釋放到細(xì)胞質(zhì)(d)。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n=8）。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。（e，f）野生型和Cse-/-小鼠紅細(xì)胞中Hb和BPGM S-硫水合的代表性圖像。野生型和Cse-/-小鼠分別給予生理鹽水或GYY4137（50 mg/kg）。治療24小時(shí)后采集血樣。使用生物素開關(guān)技術(shù)分離紅細(xì)胞，以測(cè)定Hb(e)和BPGM(f)的S-硫水合。（g，h）培養(yǎng)人紅細(xì)胞中Hb和BPGM S-硫水合的代表性圖像。分離的人紅細(xì)胞經(jīng)GYY4137（500μM）處理6小時(shí)后，收集用于測(cè)定Hb(g)和BPGM(h)的S-硫水合。