3.2.CBS和CSE產(chǎn)生的H2S抑制胎盤中sFlt-1生產(chǎn)

我們之前的研究顯示，H2S供體NaHS和前體L-半胱氨酸抑制培養(yǎng)外植體中sFlt-1釋放。鑒于sFlt-1主要由胎盤合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞合成和分泌，我們調(diào)查了H2S對培養(yǎng)合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞中sFlt-1生產(chǎn)的影響。如圖3A&B所示，用H2S供體NaHS（1-8 x 10^-5 M）和H2S前體L-半胱氨酸（0.25-2 x 10^-3 M）處理培養(yǎng)合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，導(dǎo)致sFlt-1蛋白釋放和mRNA表達劑量依賴性減少。

圖3. 硫化氫調(diào)節(jié)人胎盤細(xì)胞中sFlt-1的產(chǎn)生。A&B，硫氫化鈉和L-半胱氨酸對培養(yǎng)胎盤細(xì)胞中sFlt-1產(chǎn)生的影響。細(xì)胞用不同濃度的硫氫化鈉和L-半胱氨酸處理24小時。通過 ELISA 檢測培養(yǎng)基中sFlt-1的蛋白水平。通過實時RT-PCR測定細(xì)胞中sFlt-1的mRNA水平。C，L-半胱氨酸對CBS或CSE敲低細(xì)胞中sFlt-1產(chǎn)生的影響。細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照siRNA、CBS siRNA或CSE siRNA后，用L-半胱氨酸（2×103 M）處理24小時。通過 ELISA 檢測培養(yǎng)基中sFlt-1的蛋白水平。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n ? 4個培養(yǎng)物）。*P < 0.05，**P < 0.01 vs 載體對照或指定。

我們?nèi)缓笫褂胹iRNA方法調(diào)查了CBS和CSE是否貢獻L-半胱氨酸對胎盤細(xì)胞中sFlt-1生產(chǎn)的影響。首先，我們確認(rèn)了培養(yǎng)合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞能夠產(chǎn)生H2S，并且H2S生產(chǎn)率在存在CSE抑制劑PAG或CBS抑制劑AOAA時被抑制。然后，我們顯示L-半胱氨酸（2 x 10^-3 M）處理在轉(zhuǎn)染CSE siRNA或CBS siRNA的細(xì)胞中不能抑制sFlt-1生產(chǎn)（圖3C）。

3.3.MiR133b參與H2S對sFlt-1的效應(yīng)

由于H2S抑制sFlt-1轉(zhuǎn)錄水平，我們?nèi)缓笸ㄟ^評估sFlt-1 mRNA的半衰期檢查H2S是否影響sFlt-1 mRNA穩(wěn)定性。如圖4A&B所示，在存在mRNA合成抑制劑DRB（2.5 x 10^-5 M）的情況下，NaHS和L-半胱氨酸降低了sFlt-1 mRNA的半衰期。

圖5. 可溶性Flt-1是miR-133b的直接靶標(biāo)。A，miR-133b模擬物對胎盤細(xì)胞中sFlt-1基礎(chǔ)水平的影響。細(xì)胞經(jīng)miR-133b模擬物處理24小時后，分別通過實時RT-PCR和 ELISA 檢測細(xì)胞內(nèi)sFlt-1的mRNA水平及培養(yǎng)基中sFlt-1的蛋白濃度。B，miR-133b抑制劑對胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中sFlt-1基礎(chǔ)水平的影響。細(xì)胞經(jīng)miR-133b抑制劑處理24小時后。C，sFlt-1基因30個非翻譯區(qū)（UTR）中預(yù)測的miR-133b靶序列及其突變核苷酸。D，含sFlt-1基因30個UTR及其突變核苷酸的報告基因熒光素酶活性檢測。胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞轉(zhuǎn)染上述報告基因后，分別在有無miR-133b模擬物的條件下進行檢測。使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定細(xì)胞裂解液中的熒光素酶活性。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n ? 4組培養(yǎng)）。*P < 0.05，**P < 0.01 vs 載體對照組。

MiR可以通過其種子序列（5'端核苷酸2-8）與互補位點結(jié)合來降解mRNA靶點。生物信息學(xué)分析顯示，靶向sFlt-1的miR包括miR-133b、-182和-190。先前研究報道了先兆子癇胎盤中miR133b的變化。如圖4C&D所示，NaHS（2-8 x 10^-5 M）和L-半胱氨酸（0.5-2 x 10^-3 M）以劑量依賴性方式增強胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中miR-133b表達。

我們?nèi)缓笸ㄟ^使用這些miR的模擬物和抑制劑以及sFlt-1-3'-UTR-熒光素酶報告assay確認(rèn)sFlt-1是miR-133b的直接靶點。如圖5A&B所示，轉(zhuǎn)染miR-133b模擬物導(dǎo)致sFlt-1 mRNA表達和sFlt-1蛋白釋放減少，而miR-133b抑制劑增加細(xì)胞中sFlt-1 mRNA水平和蛋白釋放。熒光素酶報告assay確認(rèn)miR-133b靶向sFlt-1（圖5C&D）。

圖5. 可溶性Flt-1是miR-133b的直接靶標(biāo)。A，miR-133b模擬物對胎盤細(xì)胞中sFlt-1基礎(chǔ)水平的影響。細(xì)胞經(jīng)miR-133b模擬物處理24小時后，分別通過實時RT-PCR和 ELISA 檢測細(xì)胞內(nèi)sFlt-1的mRNA水平及培養(yǎng)基中sFlt-1的蛋白濃度。B，miR-133b抑制劑對胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中sFlt-1基礎(chǔ)水平的影響。細(xì)胞經(jīng)miR-133b抑制劑處理24小時后。C，sFlt-1基因30個非翻譯區(qū)（UTR）中預(yù)測的miR-133b靶序列及其突變核苷酸。D，含sFlt-1基因30個UTR及其突變核苷酸的報告基因熒光素酶活性檢測。胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞轉(zhuǎn)染上述報告基因后，分別在有無miR-133b模擬物的條件下進行檢測。使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定細(xì)胞裂解液中的熒光素酶活性。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n ? 4組培養(yǎng)）。*P < 0.05，**P < 0.01 vs 載體對照組。

3.4.MiR-133b在先兆子癇胎盤中下調(diào)

如圖6所示，先兆子癇胎盤中miR-133b水平顯著低于正常胎盤（P<0.01）。miR-133b水平與CSE和CBS表達相關(guān)（P<0.05）。

圖6. 正常與子癇前期胎盤中miR-133b的表達水平及其與CBS或CSE水平的相關(guān)性分析。A、正常胎盤（n ? 23）與子癇前期胎盤（n ? 19）中miR-133b的表達情況。B、胎盤中CBS與miR-133b水平的相關(guān)性分析。C、CSE表達與miR-133b表達的相關(guān)性分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。*P<0.05，**P<0.01。PE：子癇前期。

4.討論

本研究證明，H2S合成酶CBS、CSE和3-MST在人胎盤合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞中有表達。CSE和CSE產(chǎn)生的H2S抑制合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞中sFlt-1生產(chǎn)，且H2S的該效應(yīng)依賴于miR-133b的表達。

3-MST被報道能夠在大腦和血管內(nèi)皮中從L-半胱氨酸生成H2S。本研究首次顯示3-MST在人胎盤中有表達，并主要定位在合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞。如所述，關(guān)于胎盤中CSE和CSE定位可能存在爭議。Cindrova-Davies等人證明CBS主要定位在合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，而CSE定位在動脈平滑肌細(xì)胞。Wang等人顯示CSE定位在合胞體滋養(yǎng)層和內(nèi)皮。相反，Holwerda等人報道CBS和CSE蛋白在胎兒-胎盤內(nèi)皮中表達。這種差異可能由于個別組使用的CSE和CSE抗體來自不同公司。為了確認(rèn)胎盤中CSE和CSE定位，本研究使用了來自兩個公司的CBS和CSE抗體。我們的結(jié)果證明，由任一抗體識別的CSE和CSE陽性3-MST已被報道能夠在大腦和血管內(nèi)皮中從L-半胱氨酸生成H2S。本研究首次顯示3-MST在人胎盤中有表達，并主要定位在合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞。如所述，關(guān)于胎盤中CSE和CBS定位可能存在爭議。Cindrova-Davies等人證明CBS主要定位在合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，而CSE定位在動脈平滑肌細(xì)胞。Wang等人顯示CSE定位在合胞體滋養(yǎng)層和內(nèi)皮。相反，Holwerda等人報道CBS和CSE蛋白在胎兒-胎盤內(nèi)皮中表達。這種差異可能由于個別組使用的CSE和CBS抗體來自不同公司。為了確認(rèn)胎盤中CSE和CBS定位，本研究使用了來自兩個公司的CBS和CSE抗體。我們的結(jié)果證明，由任一抗體識別的CSE和CBS陽性染色在合胞體滋養(yǎng)層和內(nèi)皮中被鑒定。

我們之前的研究已證明，H2S對胎盤細(xì)胞中sFlt-1釋放的抑制與Flt-1脫落過程的抑制相關(guān)。在本研究中，我們顯示CSE和CBS負(fù)責(zé)內(nèi)源性H2S對胎盤細(xì)胞中sFlt-1釋放和mRNA表達的抑制。此外，我們還發(fā)現(xiàn)H2S通過降低sFlt-1 mRNA穩(wěn)定性來減少sFlt-1轉(zhuǎn)錄本，表明H2S對sFlt-1生產(chǎn)的調(diào)節(jié)可在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)生。鑒于miR可通過結(jié)合不完全配對來降解mRNA靶點，且我們之前研究已顯示H2S可影響胎盤細(xì)胞中靶向VEGF的miR表達，我們探討了H2S是否影響靶向sFlt-1的miR表達。發(fā)現(xiàn)H2S增強了靶向sFlt-1 mRNA的miR-133b表達，表明調(diào)節(jié)miR-133b表達是H2S抑制胎盤中sFlt-1生產(chǎn)的機制之一。

越來越多的證據(jù)表明，胎盤中sFlt-1生產(chǎn)增加在先兆子癇的發(fā)展和進展中起重要作用。然而，胎盤中sFlt-1生產(chǎn)增加的機制仍largely未知。我們的研究證明，通過CSE和CBS產(chǎn)生的內(nèi)源性H2S是胎盤中sFlt-1生產(chǎn)調(diào)節(jié)的重要負(fù)性因子。此外，我們還發(fā)現(xiàn)胎盤中CSE和CBS表達水平與sFlt-1表達顯著相關(guān)。鑒于CSE和CBS表達在先兆子癇胎盤中被下調(diào)，表明CSE和CBS功能障礙可能至少部分導(dǎo)致先兆子癇患者循環(huán)中sFlt-1水平升高。

我們之前研究已顯示H2S抑制靶向VEGF的miR表達。相反，本研究顯示H2S增強了miR-133b表達。本研究的局限性在于未回答H2S對不同miR產(chǎn)生相反效應(yīng)的分子基礎(chǔ)。H2S已被涉及誘導(dǎo)各種蛋白質(zhì)中半胱氨酸殘基的S-硫水化和二硫鍵。因此，研究H2S是否誘導(dǎo)負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)不同miR表達的蛋白質(zhì)功能變化是很有意義的。

5.結(jié)論

我們的結(jié)果表明，通過CSE和CBS產(chǎn)生的H2S在調(diào)節(jié)人胎盤中sFlt-1生產(chǎn)中起關(guān)鍵作用。胎盤中CSE和CBS表達減少可能有助于先兆子癇胎盤中sFlt-1生產(chǎn)升高。