2.2.特異性產(chǎn)甲烷活性測(cè)試

2.2.1.乙酸特異性產(chǎn)甲烷活性

用于批次測(cè)定的接種物是第134天從兩個(gè)消化器取出的流出物。將10 ml接種物添加到120 ml血清瓶中的無菌培養(yǎng)基（最終體積100 ml）中。血清瓶用氮?dú)鉀_洗2分鐘以提供厭氧條件。然后用丁基橡膠塞密封。無菌培養(yǎng)基由基本厭氧培養(yǎng)基和乙酸鈉（初始濃度2、4、6、8、15 g-COD/L）組成。為了模擬對(duì)照和剝離消化器中類似的conditions，無菌培養(yǎng)基的總銨態(tài)氮濃度通過氯化銨調(diào)節(jié)至6.8和5.8 g-N/L，pH通過氫氧化鈉調(diào)節(jié)至7.8。每個(gè)消化器總共設(shè)置12個(gè)血清瓶，包括兩個(gè)沒有乙酸設(shè)置的平行瓶作為對(duì)照。將瓶子在37°C培養(yǎng)直至沼氣生產(chǎn)停止。乙酸特異性產(chǎn)甲烷活性基于方程（1）計(jì)算。

特異性產(chǎn)甲烷活性（乙酸）=(1/(揮發(fā)性懸浮固體·反應(yīng)器體積·f))·(dV_CH4/dt)

其中V_CH4：累積甲烷產(chǎn)量（ml）；V_R：添加到血清瓶中的污泥體積（L）；f：化學(xué)需氧量和甲烷產(chǎn)量的轉(zhuǎn)換系數(shù)（350 ml-CH4/g-COD）；揮發(fā)性懸浮固體：接種物的揮發(fā)性懸浮固體濃度（g-VSS/L）；t：經(jīng)過的時(shí)間（天）。

2.2.2.溶解氫特異性產(chǎn)甲烷活性

使用配備H2-100微傳感器的微傳感器萬用表測(cè)量溶解氫。用于此批次測(cè)定的接種物也是第134天從兩個(gè)消化器取出。將10 ml接種物添加到120 ml血清瓶中的90 ml富氫水中。轉(zhuǎn)移后，血清瓶用氫氣沖洗2分鐘以確保足夠的氫氣濃度并形成厭氧條件。隨后，在將微傳感器插入液體底部后密封血清瓶。測(cè)定在37°C水浴中進(jìn)行直至氫氣濃度減少停止。同時(shí)，設(shè)置兩個(gè)沒有接種物的瓶子作為對(duì)照。

氫特異性產(chǎn)甲烷活性基于方程（2）計(jì)算。

特異性產(chǎn)甲烷活性（氫）=(f'/揮發(fā)性懸浮固體)·(dC_H2/dt)

其中C_H2：氫氣消耗濃度（mol/L）；f'：化學(xué)需氧量和氫氣消耗的轉(zhuǎn)換系數(shù)（16 g-COD/mol-H2）；揮發(fā)性懸浮固體：接種物的揮發(fā)性懸浮固體濃度（g-VSS/L）；t：經(jīng)過的時(shí)間（天）。

2.3.投料間乙酸、丙酸和氫代謝及產(chǎn)甲烷途徑分析

為了理解投料間（24小時(shí)）乙酸的降解，在第128-130天進(jìn)行了批次測(cè)定。測(cè)量了兩次連續(xù)投料間的甲烷產(chǎn)率、揮發(fā)性脂肪酸和溶解氫。使用標(biāo)記乙酸（2-13C）的乙酸產(chǎn)甲烷途徑分析按照先前研究進(jìn)行。接種物是第134天從兩個(gè)消化器取出。將20 ml標(biāo)記乙酸溶液添加到120 ml血清瓶中80 ml接種物中。為了模擬對(duì)照和剝離消化器類似的conditions，初始乙酸基于24小時(shí)批次測(cè)試設(shè)置為7.5和15.6 g-COD/L。瓶子用氮?dú)鉀_洗，然后用丁基橡膠塞密封。每個(gè)消化器總共設(shè)置4個(gè)血清瓶，包括兩個(gè)沒有乙酸溶液的平行瓶作為參考。將瓶子在37°C培養(yǎng)，并收集沼氣樣品用于δ13CH4和δ13CO2的穩(wěn)定碳同位素分析。重輕同位素比率（δ13C,‰）和通過CO2還原途徑產(chǎn)生的CH4分?jǐn)?shù)（f_mc）使用基于我們先前研究的方程（3）-（5）計(jì)算。

其中R_樣本：13C/12C比率，R_標(biāo)準(zhǔn)為0.0112372；δ_CH4：測(cè)量變量；δ_ma：乙酸衍生CH4的同位素值，選擇平均值-33‰；δ_mc：CO2/H2衍生CH4的同位素值，基于α_mc值，選擇1.021給α_mc。

2.4.分析方法

總固體、揮發(fā)性固體、揮發(fā)性懸浮固體、總化學(xué)需氧量、可溶性化學(xué)需氧量和總銨態(tài)氮根據(jù)美國公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)方法分析。元素質(zhì)量百分比（C、H、O、N、S）、揮發(fā)性脂肪酸濃度、氣體組成（CH4和CO2）和pH如先前所述分析。CO2和CH4的穩(wěn)定C同位素特征使用連接至低溫聚焦單元的連續(xù)流同位素比質(zhì)譜儀分析。分析精度優(yōu)于0.3‰。

游離氨氮基于方程（6）計(jì)算：

游離氨氮=(10^pH/(exp(6334/T)+10^pH))×總銨態(tài)氮

其中總銨態(tài)氮已定義，T是溫度（°K）。

2.5.微生物群落分析

為了使樣品具有代表性，在甲烷生產(chǎn)穩(wěn)態(tài)的三個(gè)不同天（第132、133和134天）從每個(gè)消化器收集樣品（10 ml），然后混合并儲(chǔ)存在-20°C直至DNA提取。使用CTAB/SDS方法提取DNA，并通過1%瓊脂糖凝膠純化。DNA稀釋至10 ng/μL后通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增16S rDNA。細(xì)菌和古菌的PCR反應(yīng)和引物已在先前研究中呈現(xiàn)。純化和定量后，PCR產(chǎn)物通過Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行配對(duì)末端測(cè)序（2x300）。根據(jù)Trimmomatic程序去除低質(zhì)量和技術(shù)序列后，將清潔序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫對(duì)齊，然后刪除嵌合體。每個(gè)樣品的序列統(tǒng)一選擇至25,000以消除測(cè)序深度差異。所有序列基于97%相似性分組為操作分類單元。此外，還計(jì)算了Chao1豐富度指數(shù)以及Simpson和Shannon多樣性指數(shù)以分析微生物多樣性。細(xì)菌和古菌的DNA序列已保存在NCBI SRA下，登錄號(hào)為PRJNA549383和PRJNA549391。