M.catarrhalis突變體構(gòu)建

(i)nsrR突變體

使用引物對(duì)WW220/WW221和WW222/WW223（圖1B和表2），以M.catarrhalis ATCC 43617基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增包含nsrR ORF立即5'和3'核苷酸序列的DNA片段。這兩個(gè)DNA片段用作重疊延伸PCR的模板，使用引物WW220和WW223。所得擴(kuò)增子命名為DNSRR，包含一個(gè)內(nèi)部SmaI位點(diǎn)，用BamHI和SacI消化，然后連接到用相同限制酶消化的M.catarrhalis質(zhì)粒克隆載體pWW115中。連接反應(yīng)混合物用于電轉(zhuǎn)化M.catarrhalis ETSU-9。從一個(gè)壯觀霉素抗性克隆中分離的質(zhì)粒命名為pWW123。從pAC7擴(kuò)增的kan盒按先前所述克隆到pWW123的DNA插入片段中的SmaI位點(diǎn)。所得重組質(zhì)粒命名為pWW124，其kan盒以與缺失的nsrR基因相同的方向插入，用作PCR擴(kuò)增模板，使用引物WW220和WW223。所得PCR產(chǎn)物命名為DNSRR-KAN，用于轉(zhuǎn)化M.catarrhalis野生型菌株O35E、7169和ETSU-9?？敲顾乜剐赞D(zhuǎn)化子通過錨定PCR和核苷酸序列分析確認(rèn)為nsrR突變體（圖1C）。通過使用上述DNSRR DNA片段轉(zhuǎn)化卡那霉素抗性的O35E nsrR突變體，構(gòu)建了一個(gè)卡那霉素敏感的nsrR突變體。一個(gè)所得卡那霉素敏感轉(zhuǎn)化子通過核苷酸序列分析確認(rèn)為nsrR缺失突變體，命名為O35E△nsrR。

圖1.卡他莫拉菌參與截短反硝化途徑的基因產(chǎn)物及相關(guān)突變體構(gòu)建示意圖。(A)卡他莫拉菌的截短反硝化途徑包含圖示的前三個(gè)酶促步驟，該菌明顯缺乏將N2O還原為N2的能力（括號(hào)標(biāo)示）。(B至D)分別顯示(B)野生型O35E菌株、(C)O35E nsrR突變體和(D)O35E aniA突變體中包含norB、nsrR和aniA基因及其側(cè)翼區(qū)域的染色體位點(diǎn)示意圖。PCR所用不同引物的相對(duì)位置通過箭頭標(biāo)示。

(ii)aniA突變體

使用引物對(duì)WW216/WW217和WW218/WW219（圖1B），以M.catarrhalis ATCC 43617基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增包含aniA ORF立即5'和3'核苷酸序列的DNA片段。這兩個(gè)DNA片段用作重疊延伸PCR的模板，使用引物WW216和WW219。所得擴(kuò)增子命名為DANIA，包含一個(gè)內(nèi)部SmaI位點(diǎn)，用BamHI和SacI消化，然后連接到用相同限制酶消化的pWW115中。連接反應(yīng)混合物用于電轉(zhuǎn)化M.catarrhalis ETSU-9。從一個(gè)壯觀霉素抗性克隆中分離的質(zhì)粒命名為pWW121，將上述kan盒克隆到pWW121 DNA插入片段中的SmaI位點(diǎn)。所得重組質(zhì)粒命名為pWW122，其kan盒以與缺失的aniA基因相同的方向插入，用作PCR擴(kuò)增模板，使用引物WW216和WW219。所得PCR產(chǎn)物命名為DANIA-KAN，用于轉(zhuǎn)化M.catarrhalis野生型菌株O35E和ETSU-9?？敲顾乜剐赞D(zhuǎn)化子通過錨定PCR和核苷酸序列分析確認(rèn)為aniA突變體（圖1D）。

(iii)aniA nsrR突變體

上述PCR擴(kuò)增子DANIA-KAN用于轉(zhuǎn)化M.catarrhalis O35E△nsrR突變體。一個(gè)卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子通過錨定PCR和核苷酸序列分析確認(rèn)為nsrR aniA雙突變體。

克隆M.catarrhalis nsrR基因用于互補(bǔ)分析

使用引物WW207和WW210（圖1B），以M.catarrhalis ATCC 43617基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增包含野生型nsrR基因的DNA片段。擴(kuò)增子連接到pWW115的SmaI位點(diǎn)，用于轉(zhuǎn)化ETSU-9。從一個(gè)壯觀霉素抗性轉(zhuǎn)化子中分離的質(zhì)粒命名為pWW150，包含野生型ATCC 43617 nsrR基因。

RNA分離和實(shí)時(shí)qRT-PCR分析

從肉湯生長(zhǎng)和生物膜生長(zhǎng)的細(xì)胞中分離總RNA，如先前所述。定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）按先前所述進(jìn)行。用于norB（MC ORF 679）、aniA（MC ORF 681）和內(nèi)生對(duì)照MC ORF 1234的qRT-PCR分析的引物對(duì)已先前描述。本研究中使用的其他引物列于表2。

通過DNA微陣列分析鑒定NsrR調(diào)控基因

從M.catarrhalis野生型菌株O35E、7169和ETSU-9細(xì)胞及其nsrR突變體在BHI肉湯中生長(zhǎng)的細(xì)胞中分離總RNA。如先前所述進(jìn)行DNA微陣列分析，以鑒定受NsrR影響的基因。進(jìn)行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)以獲得來自三個(gè)M.catarrhalis菌株對(duì)（即同時(shí)生長(zhǎng)的野生型細(xì)胞和nsrR突變體細(xì)胞）的六組RNA樣本（每組兩個(gè)樣本）。這些樣本包括一組來自7169菌株對(duì)，兩組來自ETSU-9菌株對(duì)，和三組來自O(shè)35E菌株對(duì)。進(jìn)行兩次“染料交換”實(shí)驗(yàn)，一次使用ETSU-9樣本，一次使用O35E樣本。按先前所述進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。通過qRT-PCR分析確認(rèn)NsrR調(diào)控的M.catarrhalis O35E基因表達(dá)。進(jìn)行另外兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，從M.catarrhalis O35E野生型菌株和nsrR突變體中分離兩組RNA樣本用于qRT-PCR，這些分析對(duì)每組RNA制備進(jìn)行兩次，如先前所述。