NsrR調(diào)控的M.catarrhalis基因的鑒定

DNA微陣列分析用于鑒定在全部三個nsrR突變體中，相對于相應(yīng)野生型親本菌株表達(dá)水平至少上調(diào)兩倍的基因。微陣列分析顯示，四個ORFs的表達(dá)水平在全部三個nsrR突變體中均一致增加至少兩倍（P<0.002）（圖5A）。這些ORFs是：norB（表達(dá)增加約30倍）、aniA（表達(dá)增加約30倍）、MC ORF 683（表達(dá)增加約10倍）和MC ORF 1550（表達(dá)增加2倍）。MC ORF 683編碼一種與來自Pseudoalteromonas haloplanktis的假設(shè)蛋白有39%同一性的蛋白。MC ORF 1550編碼一種與來自Psychrobacter species的光合反應(yīng)中心（PRC）桶狀結(jié)構(gòu)域蛋白有67%同一性的蛋白。PRC桶狀結(jié)構(gòu)域是在PRC亞基和一些參與RNA代謝的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一個保守結(jié)構(gòu)域。進(jìn)行qRT-PCR分析以確認(rèn)這四個ORFs的表達(dá)受NsrR負(fù)調(diào)控。在M.catarrhalis O35E nsrR突變體中，所有四個ORFs的表達(dá)相較于野生型O35E親本菌株均上調(diào)（圖5B）。最后，一個推定的NsrR結(jié)合位點存在于所有這四個ORFs的上游區(qū)域。

圖5.NsrR調(diào)控的卡他莫拉菌基因鑒定。(A)對野生型菌株O35E、7169和ETSU-9及其nsrR突變株提取的總RNA進(jìn)行DNA微陣列分析，方法詳見材料與方法部分。圖中顯示在所有三種nsrR突變株中持續(xù)上調(diào)至少兩倍（P<0.002）的基因數(shù)據(jù)。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。(B)菌株O35E的nsrR突變細(xì)胞與野生型細(xì)胞中norB、aniA、MC ORF 683和MC ORF 1550表達(dá)相對水平的qRT-PCR分析。qRT-PCR測量的內(nèi)參對照為MC ORF 1234(62)的表達(dá)。誤差棒指示最大和最小相對表達(dá)水平。

不同氮化合物對M.catarrhalis NsrR調(diào)控基因表達(dá)的影響

進(jìn)行qRT-PCR分析以檢測NO??和NO對aniA、norB、MC ORF 683和MC ORF 1550相對表達(dá)水平的影響。需要指出的是，用于檢測aniA轉(zhuǎn)錄本的引物對位于aniA ORF的5'端內(nèi)部，但在aniA突變體中缺失區(qū)域的上游。因此，在qRT-PCR中使用該引物對可以檢測到aniA突變體中截短的aniA轉(zhuǎn)錄本。

在野生型O35E菌株（圖6A）和O35E aniA突變體（圖6B）中，添加NO??使aniA的轉(zhuǎn)錄增加了約五倍。將NO??添加到野生型O35E菌株細(xì)胞中導(dǎo)致產(chǎn)生易于檢測水平的NO，而O35E aniA突變體在相同條件下產(chǎn)生很少或沒有可檢測的NO（圖7A）。這些結(jié)果表明，NsrR調(diào)控的aniA表達(dá)對NO??敏感。

圖6.含氮化合物對NsrR調(diào)控基因表達(dá)的影響。（A和B）分別從在5 mM亞硝酸鈉存在或不存在條件下培養(yǎng)的卡他莫拉菌野生型菌株O35E（A）和O35E ani4突變體（B）細(xì)胞中提取的總RNA用于qRT-PCR。（C）從在NO生成化合物精胺NONOate存在或不存在條件下培養(yǎng)90分鐘的對數(shù)生長期卡他莫拉菌O35E細(xì)胞中提取的總RNA用于qRT-PCR。顯示了norB（條形1）、aniA（條形2）、MC ORF 683（條形3）和MC ORF 1550（條形4）的相對表達(dá)水平。qRT-PCR測量的內(nèi)參對照為MC ORF 1234的表達(dá)（62）。誤差條表示最大和最小相對表達(dá)水平。

添加NO??導(dǎo)致野生型O35E菌株中norB的表達(dá)上調(diào)（即兩倍）（圖6A），但未顯著增加O35E aniA突變體中norB的表達(dá)（圖6A）。推定的NsrR調(diào)節(jié)子中另外兩個ORFs（MC ORF 683和MC ORF 1550）的表達(dá)不受NO??存在的影響（圖6A和6B）。當(dāng)將NO生成劑spermine NONOate添加到M.catarrhalis野生型菌株O35E的對數(shù)期培養(yǎng)物中，90分鐘后norB的表達(dá)增加了約兩倍（圖6C）。相比之下，aniA的表達(dá)不受NO影響（圖6C）。這些結(jié)果直接證實了aniA的表達(dá)對NO不敏感，而norB的表達(dá)對NO敏感。

圖7.卡他莫拉菌野生型O35E及其突變株的含氮化合物代謝。(A)NO2-生成NO的過程。在補(bǔ)充5 mM亞硝酸鈉的BHI培養(yǎng)基中，使用一氧化氮特異性電極監(jiān)測野生型(WT)、aniA突變株和nsrR突變株的細(xì)胞懸液在10分鐘內(nèi)產(chǎn)生NO的情況。通過NO清除劑Carboxy-PTIO能消除可測量信號的能力證實了探針特異性（未顯示）。(B)NO2-的消耗。在補(bǔ)充5 mM亞硝酸鈉的BHI培養(yǎng)基中，采用格里斯反應(yīng)法監(jiān)測野生型、aniA突變株、nsrR突變株及nsrR aniA雙突變株細(xì)胞懸液對NO2-的消耗。(C)NO的消耗。將野生型和nsrR突變株的細(xì)胞懸液暴露于通過添加10 mM ProliNO產(chǎn)生的20μM NO環(huán)境中。使用一氧化氮特異性電極監(jiān)測溶解態(tài)NO濃度。作為參照，同時測定了BHI培養(yǎng)基的NO消耗活性（虛線所示）。(D)N2O的生成。在補(bǔ)充5 mM亞硝酸鈉（在檢測開始后2分鐘加入）的BHI培養(yǎng)基中，使用一氧化二氮特異性電極監(jiān)測野生型、aniA突變株、nsrR突變株及nsrR aniA雙突變株細(xì)胞懸液產(chǎn)生N2O的情況。

M.catarrhalis對氮化合物的代謝

野生型O35E菌株能從NO??產(chǎn)生NO，而O35E aniA突變體則不能（圖7A），這證實了M.catarrhalis AniA蛋白確實是一種亞硝酸還原酶，能夠通過還原NO??產(chǎn)生NO。此外，研究表明O35E nsrR突變體消耗NO??的速度遠(yuǎn)快于野生型親本菌株O35E（圖7B）。這很可能是由于O35E nsrR突變體中AniA表達(dá)升高所致，因為O35E aniA突變體在同一時間段內(nèi)不消耗NO??（圖7B）。更重要的是，在O35E nsrR突變體中失活aniA基因完全消除了NO??的消耗（圖7B）。

對M.catarrhalis菌株消耗NO的檢查表明，O35E nsrR突變體消耗NO的速度遠(yuǎn)快于O35E野生型菌株（圖7C）。這很可能是由于nsrR突變體中norB表達(dá)增加所致。nsrR突變體對NO的快速消耗解釋了該突變體從NO??產(chǎn)生的可檢測NO水平非常低的原因（圖7A）。

在初步實驗中，M.catarrhalis O35E nsrR突變體產(chǎn)生的N?O水平遠(yuǎn)高于其親本菌株；具體而言，nsrR突變體在大約50分鐘內(nèi)從5 mM NaNO?產(chǎn)生了2.5 mM N?O，而野生型親本菌株在相同時間內(nèi)僅產(chǎn)生約0.4 mM N?O。正如預(yù)期，失活aniA基因?qū)е翺35E aniA突變體和O35EΔnsrR aniA突變體均無法從亞硝酸鹽檢測到N?O的產(chǎn)生（圖7D）。