材料與方法

標(biāo)本

采集常見尺寸（體長(zhǎng)約30毫米）的標(biāo)本，來自美國(guó)路易斯安那州巴吞魯日（30°24.98'N 91°7.18'W）的一根橡木原木，并將其與采集時(shí)所在的木塊一起保存在單獨(dú)的容器中。解剖和細(xì)菌/古菌群落鑒定在采集日期后約2周進(jìn)行。

甲蟲解剖、DNA提取和pH測(cè)量

將甲蟲在95%乙醇中浸泡2分鐘進(jìn)行表面消毒，然后用無菌磷酸鹽緩沖鹽水清洗。在無菌磷酸鹽緩沖鹽水中解剖單個(gè)甲蟲，首先去除鞘翅以暴露膜質(zhì)背側(cè)。隨后，去除翅膀，解剖角質(zhì)膜以暴露腹腔內(nèi)的自然腸道排列（圖1）。然后取出整個(gè)腸道，拉伸并切成四個(gè)區(qū)域（前腸-FG、中腸-MG、前中腸-AHG、后后腸-PHG；圖1b）。將每個(gè)區(qū)域放入1ml RNALater（Qiagen,Valencia,CA,USA）中，并在提取前于4°C儲(chǔ)存過夜。通過將每個(gè)腸道區(qū)域在含有750μl RLT（硫氰酸胍）緩沖液（Qiagen）的Lysing Matrix E管（Qbiogene Inc.,Carlsbad,CA,USA）中珠磨30秒（5.5 m s-1），冷卻1分鐘，再重復(fù)該過程30秒，制備粗提物。使用標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿相分離技術(shù)從混合物中分離核酸，并用乙醇沉淀。使用AllPrep DNA/RNA Kit（Qiagen）根據(jù)制造商說明進(jìn)一步純化粗核酸提取物，以同時(shí)分離DNA和RNA組分。在另一組四只甲蟲中，通過解剖出每個(gè)部分并將腸道內(nèi)容物在30%水（w v-1）中勻漿，再用微電極測(cè)量每個(gè)腸道區(qū)域的pH。

用于PhyloChip分析的PCR擴(kuò)增

我們的實(shí)驗(yàn)包括四只甲蟲（重復(fù)）和每只甲蟲的四個(gè)腸道區(qū)域（16個(gè)樣本）。每個(gè)樣本進(jìn)行三次重復(fù)反應(yīng)，使用三種不同的退火溫度進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，使用5μl 1 x Takara ExTaq PCR緩沖液（含MgCl2）、300 pM引物27F（5'-GTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）用于細(xì)菌，1492R和4F（5'-TCCGGTTGATCCTGCCRG-3'）用于古菌，50μg牛血清白蛋白，200μM dNTPs，2.5 U ExTaq DNA聚合酶（Takara Mirus Bio Inc.,Madison,WI,USA），5ng模板和milliQ H2O補(bǔ)足至50μl體積。PCR循環(huán)條件為：95°C初始變性3分鐘，然后進(jìn)行25個(gè)循環(huán)：95°C 30秒，退火48°C、53°C和56°C 25秒，72°C延伸2分鐘，最后72°C延伸10分鐘。將三種不同退火溫度的產(chǎn)物（150μl）合并，并使用乙醇沉淀（15μl 3M乙酸鈉和300μl 100%乙醇）進(jìn)行濃縮。將沉淀重懸于TE（Tris-EDTA）緩沖液中，并在通過凝膠電泳定量前使用PCR純化試劑盒（Qiagen）進(jìn)行純化。

PhyloChip雜交和樣本檢測(cè)

微陣列構(gòu)建、標(biāo)記、雜交、檢測(cè)和定量方法由Brodie等人詳細(xì)描述。G2 PhyloChip包含超過300,000個(gè)探針，靶向8741個(gè)細(xì)菌和古菌分類群。從合并的PCR反應(yīng)中，取200ng細(xì)菌和50ng古菌PCR產(chǎn)物，用DNAse I片段化，生物素標(biāo)記，根據(jù)制造商推薦的方案進(jìn)行雜交、洗滌和染色。總共分析了16個(gè)微陣列。每個(gè)PhyloChip被掃描并記錄為像素圖像，使用標(biāo)準(zhǔn)Affymetrix軟件（GeneChip微陣列分析套件，版本5.1，Santa Clara,CA,USA）進(jìn)行初始數(shù)據(jù)采集和強(qiáng)度測(cè)定。當(dāng)某個(gè)分類群/OTU（操作分類單元）超過90%的指定探針對(duì)在至少三個(gè)重復(fù)（每個(gè)腸道區(qū)域四個(gè)重復(fù)）中呈陽性時(shí)，則認(rèn)為該分類群存在于樣本中。

PhyloChip檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均在R編程環(huán)境（The R Development Core Team,2010）中進(jìn)行。對(duì)與擴(kuò)增子靶標(biāo)定量相關(guān)的變異以及下游與靶標(biāo)片段化、標(biāo)記、雜交、洗滌、染色和掃描相關(guān)的變異進(jìn)行了校正，具體方法詳見Ivanov等人。使用方差分析檢驗(yàn)每個(gè)分類群/OTU在四個(gè)腸道區(qū)域中的強(qiáng)度是否顯著。使用Benjamini-Hochberg錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率程序?qū)Φ玫降腜值進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正。使用Goldfarb等人中詳述的方法生成檢測(cè)到的細(xì)菌分類群的系統(tǒng)發(fā)育樹，并使用交互式生命樹網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器進(jìn)行可視化和注釋。

系統(tǒng)發(fā)育群落分析

使用Picante R包進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育群落分析。使用G2 PhyloChip靶向序列的最大似然RAxML樹作為初始樹。從未在腸道區(qū)域檢測(cè)到或具有模糊名稱的分類群從樹中修剪掉，得到一個(gè)包含1382個(gè)分類群的樹。我們使用了末端洗牌零模型（模型1），運(yùn)行10000次重復(fù)。在該模型中，末端（單個(gè)分類群）在整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育中洗牌，并將得到的指標(biāo)與觀察值進(jìn)行比較，α=0.05。末端洗牌模型被確定對(duì)Phylocom分析具有穩(wěn)健性，且I類錯(cuò)誤（假陽性）水平較低。我們使用凈親緣關(guān)系指數(shù)（NRI）指標(biāo)來比較不同腸道區(qū)域微生物群落的系統(tǒng)發(fā)育聚類。我們還確定了系統(tǒng)發(fā)育多樣性（PD）和香農(nóng)多樣性指數(shù)（H'；表1）。

表1 鍬甲蟲腸道各區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育群落指標(biāo)0. disjunctus腸道菌群的多樣性與功能

通過15N2摻入確認(rèn)固氮作用

將四只甲蟲放入一個(gè)麻醉箱中，該箱連接到一個(gè)裝有66 ml O2的氣球，并用99原子%15N2沖洗以達(dá)到約78%的N2濃度。孵育12天后，對(duì)箱子進(jìn)行吹掃，取出甲蟲進(jìn)行解剖和核酸提取，方法同上。通過將提取物移液到錫膠囊中的Chromosorb W（Advanced Minerals,Santa Clara,CA,USA）上，制備用于同位素分析的RNA提取物。使用RoboPrep-CN分析儀與20-20型同位素比質(zhì)譜儀（Sercon Ltd.,Cheshire,UK）聯(lián)用，分析樣品的N含量和δ15N。