結(jié)果

甲蟲內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)

圖1a顯示了O.disjunctus腹腔內(nèi)的背側(cè)腸道排列。FG位于頭部和部分胸腔內(nèi)（未解剖）。盤繞的MG、AHG和PHG位于腹腔內(nèi)。盤繞的MG（圖1b）從胃盲囊延伸到馬氏管。向后，腸道突然變寬成一個(gè)囊袋區(qū)域，即AHG，它位于一層氣管管上方（不可見）；細(xì)長(zhǎng)的PHG緊鄰AHG后方，同樣被氣管管包圍。整個(gè)背側(cè)腹腔被一層厚厚的角質(zhì)層覆蓋，并由一對(duì)翅膀（已移除）保護(hù)，這對(duì)翅膀鎖在一起，僅在飛行時(shí)打開，而該物種很少飛行。整個(gè)腸道的典型長(zhǎng)度約為11厘米，F(xiàn)G是最短的區(qū)域，MG是最長(zhǎng)的區(qū)域。

我們用于陣列分析的四只解剖甲蟲的腸道片段重量均勻：FG=13.3±2.1mg，MG=263.5±37.9mg，AHG=125.5±21.4 mg，PHG=47±6.5mg。所有單個(gè)腸道片段均產(chǎn)生至少200 ng總（原核和真核）DNA/RNA，用于PCR擴(kuò)增和cDNA合成。所有腸道區(qū)域的細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增均成功。然而，古菌16S rRNA基因僅在AHG中成功擴(kuò)增。在另一組甲蟲中測(cè)量了pH，每個(gè)腸道區(qū)域的平均pH為：FG=7.44±0.21，MG=8.38±0.12，AHG=7.21±0.05，PHG=6.89±0.18。

氧氣分布

黑蜣科甲蟲腸道呈現(xiàn)出一組復(fù)雜的微環(huán)境，因?yàn)榇嬖谥辽偎膫€(gè)形態(tài)上不同的區(qū)域（圖1b）。為了更好地理解微生物組成或活性的任何區(qū)室化，使用微電極測(cè)量了每個(gè)腸道區(qū)域內(nèi)不同位置的O2分布（圖2）。在每次測(cè)量期間，使用顯微操縱器將尖端驅(qū)動(dòng)到腸道壁表面，并使用數(shù)字顯微鏡進(jìn)行監(jiān)控，并將其保持在該位置，直到測(cè)量到穩(wěn)態(tài)的O2讀數(shù)（約1分鐘）。在每種情況下，一旦電極尖端穿透腸道壁，氧氣濃度迅速下降，出現(xiàn)陡峭的梯度，直到觀察到氧氣完全耗盡。厭氧區(qū)域不僅在AHG中，而且在所有四個(gè)腸道區(qū)域中都占據(jù)了體積優(yōu)勢(shì)（圖2）。

在許多白蟻中，類似的厭氧區(qū)僅限于后腸囊。將電極尖端連續(xù)移動(dòng)穿過甲蟲腸道直到到達(dá)對(duì)側(cè)，顯示出的O2分布與進(jìn)入腸道時(shí)獲得的分布呈鏡像。通過測(cè)量Nardi等人報(bào)道的圖像中AHG和PHG的腸壁厚度，并根據(jù)本文確定的O2分布，所有腸道區(qū)域的特征都是從微需氧條件到管腔中厭氧條件的快速轉(zhuǎn)變。考慮到腸壁厚度<100μm，F(xiàn)G和MG中氧氣可利用范圍>300μm，而AHG和PHG分別約為50μm和280μm，其中腸壁厚度分別為200μm和110μm。

腸道區(qū)域群落組合

對(duì)于群落組成分析，當(dāng)一個(gè)分類群在至少三個(gè)重復(fù)（每個(gè)腸道區(qū)域四個(gè)重復(fù)）中高于檢測(cè)閾值（pf>=0.90）時(shí)，才被認(rèn)為存在。基于這些標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)G的豐富度最高，其次是PHG，然后是MG和AHG。在一系列pf閾值（0.90-1.0；）下觀察到這種模式，其中豐富度模式在R為0.98和0.99之間相關(guān)。PD和香農(nóng)多樣性指數(shù)支持了豐富度測(cè)量所暗示的模式，即FG是多樣性最高的腸道區(qū)域，其次是PHG、MG和AHG。

所有16個(gè)腸道區(qū)域的層次聚類（圖3）表明，F(xiàn)G和AHG形成了兩個(gè)不同的簇，而MG和PHG群落沒有被解析，而是按單個(gè)甲蟲聚集在一起。特定分類群的相對(duì)豐度（探針集強(qiáng)度）在不同腸道區(qū)域之間也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。檢測(cè)到的分類群的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示了四個(gè)腸道區(qū)域中細(xì)菌分類群的平均相對(duì)豐度（白色到紅色的梯度環(huán)表示相對(duì)豐度增加；圖4）。

最外層的環(huán)（黑色）顯示了在至少兩個(gè)腸道區(qū)域之間相對(duì)豐度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的分類群。檢測(cè)到的大多數(shù)分類群（75%）在不同腸道區(qū)域之間的分布顯示出顯著差異。

為了檢驗(yàn)每個(gè)腸道區(qū)域作為不同環(huán)境過濾器的假設(shè)，我們?cè)u(píng)估了每個(gè)腸道區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育聚類。系統(tǒng)發(fā)育聚類由NRI表示，其中增加的正值代表群落按系統(tǒng)發(fā)育親緣關(guān)系更聚集，而增加的負(fù)值代表更分散的系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)。我們的結(jié)果表明，每個(gè)腸道區(qū)域內(nèi)的群落都顯著聚集，F(xiàn)G和PHG區(qū)域顯示出最大的聚集性（P<0.001；表1）。

O.disjunctus消化道的相鄰區(qū)域顯示出其細(xì)菌群落組成的變化（圖5）。

需氧類群如放線菌目（Actinomycetales）、伯克霍爾德菌目（Burkholderiales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、著色菌目（Chromatiales）、固氮螺菌目（Azospirillales）、慢生根瘤菌目（Bradyrhizobiales）和亞硝化單胞菌目（Nitrosomonadales）在腸道的兩端（FG和PHG）富集，而在中央?yún)^(qū)域（MG和AHG）豐度較低。厭氧細(xì)菌類群包括擬桿菌目（Bacteroidales）、梭菌目（Clostridiales）、螺旋體目（Spirochaetales）、脫硫桿菌目（Desulfobacterales）、脫硫單胞菌目（Desulfomonadales）、互營桿菌目（Syntrophobacterales）和熱袍菌目（Thermotogales），相對(duì)于MG和PHG，在AHG中富集。產(chǎn)甲烷菌，包括甲烷微菌科（Methanomicrobiaceae）、甲烷螺菌科（Methanospirillaceae）和甲烷八疊球菌科（Methanosarcinaceae），僅在AHG中檢測(cè)到（圖6a和b）。

通過454焦磷酸測(cè)序16S rRNA基因V9區(qū)域也評(píng)估了與黑蜣科甲蟲不同區(qū)域相關(guān)的微生物群落。該分析證實(shí)了PhyloChip獲得的結(jié)果，即微生物類群的分布，即需氧細(xì)菌在FG和PHG中更豐富，厭氧細(xì)菌在AHG和MG中占主導(dǎo)地位，并且AHG棲息著產(chǎn)甲烷古菌。群落β多樣性的UPGMA（非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法）聚類顯示出與PhyloChip相似的聚類模式，F(xiàn)G和AHG聚類在分化良好的進(jìn)化枝中，而MG和PHG聚集在一起，但主要根據(jù)甲蟲而不是腸道區(qū)域進(jìn)行聚類，正如PhyloChip分析所觀察到的那樣。

NifH表達(dá)和豐富nifH轉(zhuǎn)錄本的系統(tǒng)發(fā)育

首先通過將甲蟲在15N2頂空環(huán)境中孵育12天，然后解剖并對(duì)提取的腸道RNA進(jìn)行整體同位素比質(zhì)譜分析，來分析固氮作用。所有四個(gè)區(qū)域都顯示出15N2富集。盡管由于需要較長(zhǎng)的孵育時(shí)間（約12天）才能達(dá)到15N檢測(cè)，從這些分析中確認(rèn)N2固定活性的位置很困難。為了評(píng)估每個(gè)腸道區(qū)域的N2固定潛力，通過qPCR評(píng)估了nifH基因表達(dá)，并標(biāo)準(zhǔn)化為rpoB基因的表達(dá)。在整個(gè)腸道中，F(xiàn)G中的表達(dá)水平最低；其CT值用作相對(duì)定量的校準(zhǔn)品（表2）。相對(duì)于FG，AHG中的nifH表達(dá)高出26.7倍，MG中高出4.7倍，PHG中高出2.4倍。通過克隆和系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定了N2固定類群。

在所有腸道區(qū)域中，優(yōu)勢(shì)類群是一組與Paludibacter propionicigenes的Ni-Fe固氮酶相關(guān)（相似性93-96%）的序列。此外，在FG中鑒定出與Clostridium cellobioparum、Azoarcus sp.和Bradyrhizobium japonicum相關(guān)的nifH序列，而MG包含與Azorrhizobium doebereineae、Bradyrhizobium denitrificans和Beijerinckia sp.相關(guān)的序列。與所有其他腸道區(qū)域一樣，AHG中鑒定的大多數(shù)序列也與P.propionicigenes相關(guān)，部分序列與C.lentocellum相關(guān)。PHG顯示出三個(gè)主要的nifH序列組，（1）與P.propionicigenes相關(guān)的一組，（2）另一個(gè)與需氧固氮菌Methylocapsa sp.相關(guān)，以及（3）與C.cellobioparum相關(guān)的一組。