討論

O.disjunctus是一種黑蜣科甲蟲，是一種大型且眾所周知的節肢動物食碎屑動物，廣泛分布于北美東部和加拿大南部。這些甲蟲表現出亞社會行為，棲息在腐爛的硬木中，并以低營養飲食為生，這一特征在白蟻中已被證明需要共生微生物（如細菌和鞭毛蟲）的存在，這些微生物有助于固氮和木質纖維素消化。

黑蜣科甲蟲提供了一個有用的天然模型來研究微生物群落在植物細胞壁降解中的作用，因為它能夠以腐爛木材的低營養飲食為生，其中許多涉及的降解過程需要微生物酶的活性。在這項研究中，我們首次深入了解了這種甲蟲消化道中的微生物群落組裝、其功能的一個方面（N固定）以及可能調節微生物組成和活性的生理梯度（O2、pH）。我們假設，腸道區域之間觀察到的形態和生理差異允許在每個腸道區域內存在不同的微生物種群和活性。

一些可能影響后腸微生物群落組合的因素包括氧氣可用性、pH、氧化還原電位以及生物之間的相互作用。O2分布的分析顯示，所有腸道區域都形成了O2梯度，其特征是從微需氧條件到厭氧條件的快速轉變，氧氣可利用區域的深度在FG和MG中比在AHG和PHG中更大。氧氣梯度在白蟻中已被廣泛表征；然而，與黑蜣科甲蟲不同，已知白蟻如Microcerotermes parvus和Reticulitermes flavipes僅在囊部（一種類似于O.disjunctus中AHG的消化結構）或Nasutitermes lujae的后后腸后半部分充當“氧氣匯”。在所有腸道區域都存在達到厭氧條件的O2梯度，這使得黑蜣科甲蟲成為一個獨特的系統，用于研究微生物種群沿腸道區域和跨腸道區域的排列以及代謝過程，如木材大分子的降解和潛在生物燃料（如CH4和H2）的產生。為了表征O.disjunctus腸道中的pH變化，我們進行了腸道內容物的整體pH測量，其方法與Bignell和Eggleton用于測定白蟻腸道pH的方法相當。與至少一個腸道區域（后腸或囊部）呈極堿性（高達10.5）的高等白蟻不同，我們發現甲蟲腸道環境不那么極端，盡管MG是堿性的（pH 8.38；表1）。這與許多其他昆蟲和哺乳動物腸道中發現的pH條件形成對比，這些腸道需要高度堿性或酸性環境才能進行適當的食物消化。

總的來說，系統發育微陣列和454焦磷酸測序數據顯示，在大多數腸道區域中，門內的豐富度順序為變形菌門（Proteobacteria）>厚壁菌門（Firmicutes）>放線菌門（Actinobacteria）>擬桿菌門（Bacteroidetes），但AHG區域除外。這里的豐富度順序為厚壁菌門（Firmicutes）>變形菌門（Proteobacteria）>擬桿菌門（Bacteroidetes）>放線菌門（Actinobacteria），表明選擇了一個獨特的種群。觀察到的MG和PHG之間多樣性和群落結構的相似性可能與這些區域的形態有關，MG和PHG都缺乏在AHG中看到的復雜的腸道結構，這些結構可能支持微生物庫的建立。FG和AHG的高度聚集的微生物組合和多樣性模式也可能與O2可用性有關。FG中O2滲透距離更大，同時厭氧區相對于AHG減少（圖2），這可能解釋了特定微生物類群的不同分布。例如，需氧固氮細菌和放線菌在FG中相對更豐富，而在AHG中未檢測到或相對豐度較低。盡管FG在重量上比其他區域小，但其細菌多樣性最高。相比之下，AHG的多樣性最低，O2可用性也最低（圖2）。所有腸道區域在系統發育上都是聚集的，表明發生了棲息地過濾。因此，盡管FG區域在檢測到的分類群數量、香農多樣性和總系統發育距離（Faith's PD）方面是最多樣化的，但FG中的生物彼此之間的關系比AHG中的生物更密切（表1）。這一發現出乎意料，但可能與O2作為末端電子受體的相對豐度有關。

與其他腸道區域不同，AHG在形態上高度分化，顯示出內部囊袋和突起，這將允許空間分離，促進更高多樣性的生態位，從而產生更高的分類學多樣性，正如在其他昆蟲腸道中觀察到的那樣。然而，較低的O2滲透和更廣泛的厭氧區可能導致較低的電子受體多樣性，這可能會抵消空間分離對該區域多樣性的影響（圖5）。在比較所有腸道區域的微生物組成時，AHG的特征是厭氧類群的富集，這些類群可能有助于重要的代謝過程，如木質纖維素材料的轉化、N2固定、H2和CH4的產生。只有在這個區域內才檢測到產甲烷菌，如甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）。有趣的是，甲烷氧化菌如甲基球菌目（Methylococcales）在與AHG相鄰的區域（可能是甲烷的來源）檢測到的相對豐度更高（圖5）。在AHG中，我們檢測到一些厭氧類群的代表，這些類群因其在生物技術中的重要性而被廣泛研究，例如產H2的C.tyrobutyricum，或芳香族o-脫甲基化同型產乙酸菌C.methoxybenzovorans。同樣在AHG中富集的螺旋體，已被報道為白蟻腸道生物區系的重要組成部分，因為它們具有固氮和纖維素降解能力，盡管在這種情況下我們沒有看到該組中nifH基因表達的證據。在AHG中，擬桿菌門（Bacteroidetes）包括紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）相對于鄰近區域富集（圖4）。FG和PHG區域的特征是需氧細菌的相對豐度較高，特別是纖維素分解類群，如Cellulophaga、Cellulosimicrobium以及需氧固氮生物，如慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和拜葉林克氏菌屬（Beijerinckia）。顯然，甲蟲腸道可以被視為一個復雜的系統，其中代謝過程似乎是空間分散的。

在所有腸道區域都存在達到完全O2耗盡的徑向O2梯度，以及這些甲蟲賴以生存的木質生物量的高C:N比，預計會選擇固氮作用。我們首先通過15N2同位素比質譜法評估了這種可能性，并證明所有腸道區域都發生了15N2富集。為了確定固氮的可能位置，通過使用nifH-qPCR對固氮酶基因表達進行定量。這表明nifH表達在AHG中最高（比FG高27倍；表2），主要的nifH轉錄本序列與紫單胞菌目（Porphyromonadales）成員P.propionicigenes的Ni-Fe固氮酶以及梭菌目（Clostridiales）成員C.lentocellum（一種纖維素分解固氮細菌）的Ni-Fe固氮酶相關。NifH表達結果證實了我們的假設，即由于不同的生理條件（即每個腸道區域O2濃度的變化）導致微生物組成和功能分離。nifH轉錄本的序列分析與系統發育微陣列分析非常吻合，證實了FG、MG和PHG中存在需氧固氮細菌，以及厭氧生物如梭菌目（Clostridiales）和紫單胞菌目（Porphyromonadales）。重要的是，在所有腸道區域都檢測到nifH表達，并且FG、MG和PHG不僅包含與P.propionicigenes相關的固氮細菌轉錄本，還包含需氧固氮細菌類群。這種需氧和厭氧固氮菌的共存可能與整個甲蟲腸道中微需氧區域的存在有關，并表明N2固定存在一定程度的功能冗余。如前所述，未檢測到螺旋體相關的nifH轉錄本；這一觀察結果可能與引物偏倚無關，因為相同的nifH引物被用于鑒定白蟻中的固氮螺旋體。這表明，與白蟻后腸中螺旋體是主要固氮類群不同，在黑蜣科甲蟲腸道中，這一作用主要由擬桿菌門物種（Paludibacter）和其他生物承擔。

我們的多尺度方法表明，黑蜣科甲蟲的腸道是一個高度區室化的環境，具有明確分層的微生物群落，范圍從具有高多樣性需氧類群的區域（FG、PHG）到主要由厭氧細菌主導的AHG。黑蜣科甲蟲腸道擁有高度多樣化的固氮細菌群落，其優勢生物與P.propionicigenes相關，而不是在白蟻中發揮這一作用的螺旋體。甲蟲腸道的特征是存在徑向O2梯度，達到厭氧條件，在管腔內的所有區域中占主導地位。基于此，有氧和厭氧過程很可能在近距離內發生，并有助于這種昆蟲中木質纖維素降解的效率。了解這些種群如何在區域之間和跨梯度相互作用以促進這種昆蟲的營養，是進一步研究的主題，并將提高我們優化木質纖維素生物燃料生產過程的能力。