2.2.DNA的分離、操作和轉移

大腸桿菌的高純度質粒DNA通過使用peqGOLD質粒小量制備試劑盒I獲得，而質量較低的質粒DNA則基于Birnboim和Doly的方法進行分離。通過凝膠提取純化DNA片段或質粒DNA是使用Fermentas GmbH的PureExtreme GeneJet凝膠提取試劑盒根據制造商手冊進行的。用于DNA消化的限制性內切酶也從Fermentas GmbH購買，并按說明使用。來自同一公司的Plusion高保真DNA聚合酶用于基于PCR的擴增，擴增在peqSTAR 2X梯度熱循環儀上進行。所需的引物由MWG-Biotech AG合成。連接反應使用來自Fermentas GmbH的T4 DNA連接酶進行。感受態大腸桿菌細胞的制備和轉化是根據Sambrook等人描述的CaCl2方法進行的。DNA測序由Seqlab進行，獲得的序列使用NCBI服務器的BLAST工具進行分析。

質粒pET-23a::acd_dpn7用作構建用于表達Acd_DPN7變體的突變質粒的模板。PCR擴增使用Plusion DNA聚合酶進行。使用兩個磷酸化引物（其中一個攜帶突變的DNA序列）來擴增整個質粒。PCR在補充有1%(v/v)DMSO的Plusion高保真緩沖液中進行。在98°C初始變性4分鐘后，樣品在peqSTAR 2X梯度熱循環儀中經受30個循環的變性（98°C，20秒）、退火（61-64°C，30秒）和延伸（72°C，2.5分鐘）。PCR產物從瓊脂糖凝膠中純化，用來自Fermentas GmbH的T4 DNA連接酶連接，隨后轉化到CaCl2感受態的大腸桿菌Top10細胞中。通過質粒DNA的DNA測序鑒定攜帶所需突變的陽性克隆。然后將質粒轉化到表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)pLysS的CaCl2感受態細胞中。

2.3.Acd_DPN7和酶變體的表達與純化

Acd_DPN7和酶變體在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS細胞中的表達如前所述進行。隨后通過離心（4°C，3400g，15分鐘）收獲細胞，并用無菌鹽水溶液洗滌兩次。棄去上清液，將沉淀物在-20°C下儲存。對于His6標簽純化，將細胞重懸于結合緩沖液（100 mM Tris-HCl，500 mM氯化鈉，20 mM咪唑，pH 7.4）中。通過在100 MPa壓力下三次通過冷卻的French press進行裂解。在4°C下以10,000g離心1小時后獲得可溶性蛋白質級分。His SpinTrap親和柱用于純化初始測試所需的小量酶，按照制造商的說明進行。為此，Ni-次氮基三乙酸(NTA)柱用上述結合緩沖液平衡。使用相同組成和pH但含有40 mM咪唑的緩沖液進行洗滌步驟，而洗脫緩沖液需要500 mM的咪唑濃度。對于大規模純化，將兩個體積為1 ml的HisTrap HP柱串聯連接，并用五倍體積的上述結合緩沖液平衡。隨后，使用相同組成但咪唑濃度分別為100和150 mM的緩沖液進行兩個洗滌步驟，從而獲得更高的蛋白質純度。用500 mM咪唑洗脫蛋白質。純化的蛋白質以2 mg ml-1的濃度在補充有終濃度為50%(v/v)甘油的洗脫緩沖液中于-20°C儲存。蛋白質濃度根據Bradford方法測定。

為了在結晶前進一步提高純度，Acd_DPN7經過尺寸排阻色譜步驟。Superdex 200 HP 16/600柱用含有150 mM氯化鈉、pH調節至7.4的20 mM磷酸鈉緩沖液平衡。使用高分子量凝膠過濾校準試劑盒進行校準，包括卵清蛋白(44 kDa)、伴清蛋白(75 kDa)、醛縮酶(158 kDa)和鐵蛋白(440 kDa)，按照制造商手冊進行。將含有純化酶的總體積為1 ml的樣品上樣到柱上。色譜法在1 ml min-1的恒定流速下進行。通過監測280 nm處的吸光度來確定洗脫體積。收集含有Acd_DPN7的樣品，合并并置換到10 mM HEPES緩沖液pH 7.4中。

2.4.酶測定

為了檢查脫亞磺酰酶活性，底物3SP-CoA是根據先前描述的程序合成的。連續分光光度測定法利用5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)與亞硫酸鹽的反應，導致412 nm處的吸光度增加。動力學活性通過一式三份測定，使用含有0.2 mM DTNB和不同濃度（0.2、0.15、0.1、0.075、0.05、0.025、0.0125、0.0075、0.005和0.0025 mM）的3SP-CoA的測定液，在30°C下于50 mM Tris-HCl pH 7.4中進行。通過加入10μl純化酶開始反應，最終蛋白質濃度為2μg ml-1(44.6 nM)，除非另有說明。一個單位的活性對應于在1分鐘內催化轉化1μmol底物的酶量。

為了研究Acd_DPN7_Q246E突變體催化各種酰基輔酶A硫酯（丙酰輔酶A、丁酰輔酶A、異丁酰輔酶A、戊酰輔酶A、異戊酰輔酶A、3SP-CoA、琥珀酰輔酶A和戊二酰輔酶A）脫氫的能力，使用了基于六氟磷酸二茂鐵鎓的測定法。簡而言之，測定液含有0.2 mM六氟磷酸二茂鐵鎓和0.1 mM相應的輔酶A硫酯，在50 mM Tris-HCl pH 7.4中，總體積為1 ml，最終酶濃度為2μg ml-1(44.6 nM)。在300 nm處觀察吸光度。

2.5.AcdDPN7的潛在氧依賴性評估方法  

檢測體系總體積為1 ml，包含終濃度0.2 mM DTNB和0.1 mM 3SP-CoA的50 mM Tris-HCl緩沖液（pH 7.4），置于配備橡膠密封墊的比色皿（型號117.104-QS，光程10 mm；Hellma Analytics公司，德國米爾海姆）中。將950 μl檢測液通過通入氮氣或氧氣5分鐘，分別制成厭氧或氧飽和狀態。同時，將含AcdDPN7的50 mM Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）通過氮氣吹掃制成厭氧狀態。隨后，該溶液在配備橡膠密封墊的玻璃瓶（型號548-0028和548-0032，VWR International GmbH公司，德國達姆施塔特）中冰上冷卻。通過連接氣鋼瓶的進氣管針持續通氮氣10分鐘置換頂空氣體，另設一出氣管針避免超壓。最后，使用上述連續光譜分析法監測AcdDPN7在缺氧與有氧條件下的活性。于30℃預孵育1分鐘后，加入50 μl無氧酶溶液啟動反應，在412 nm波長處持續監測吸光度變化9分鐘。  

體系缺氧或富氧狀態使用氧微呼吸傳感器（OX-MR，Unisense公司，丹麥奧胡斯）連接皮安電流計（PA2000，Unisense公司，丹麥優尼森）按制造商說明進行檢測。傳感器采用壓縮空氣飽和水溶液（20℃時284 μM O?）和0.1 M抗壞血鈉/0.1 M NaOH水溶液（20℃時0 μM O?）進行校準。