2.材料與方法

2.1.采樣

圖1.維戈河口地圖上的采樣點(diǎn)位置。

在維戈河口（圖1）進(jìn)行了五個(gè)時(shí)間序列實(shí)驗(yàn)，用水取自Toralla碼頭，時(shí)間跨越大洋涌升季節(jié)末期（夏末）和下沉流季節(jié)（秋季和冬季）的不同時(shí)間。

2.2.葉綠素a

在0、24和48小時(shí)測(cè)定葉綠素a濃度。初始葉綠素a樣品直接從50升聚乙烯桶中采集。將四個(gè)額外的50毫升瓶子和兩個(gè)125及570毫升瓶子與呼吸瓶一起培養(yǎng)，以測(cè)定24和48小時(shí)后的葉綠素a濃度。水樣（100-150毫升）通過(guò)0.2微米孔徑、直徑47毫米的聚碳酸酯濾膜過(guò)濾。濾膜立即冷凍。葉綠素a濃度使用Turner 10-AU熒光計(jì)測(cè)定，該熒光計(jì)用純?nèi)~綠素a標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)，樣品在4°C下用90%丙酮提取約24小時(shí)。

2.3.細(xì)菌豐度

在時(shí)間序列3-時(shí)間序列5中，在0、24和48小時(shí)測(cè)定細(xì)菌豐度。零時(shí)樣品直接從50升聚乙烯桶中采集。24和48小時(shí)樣品取自用于葉綠素a測(cè)量的相同額外培養(yǎng)瓶。5毫升海水通過(guò)0.2微米孔徑、直徑25毫米的聚碳酸酯濾膜過(guò)濾。細(xì)菌數(shù)量來(lái)源于DAPI混合染色細(xì)胞的顯微鏡計(jì)數(shù)得出的原核生物豐度。根據(jù)Teira等人的方法，DAPI混合物由5.5份Citifluor、1份Vectashield和0.5份含有DAPI（終濃度1微克/毫升）的磷酸鹽緩沖鹽水組成。

2.4.微型浮游生物豐度

在時(shí)間序列3-時(shí)間序列5中，在0、24和48小時(shí)分析微型浮游植物組成。零時(shí)樣品直接從50升聚乙烯桶中采集，而每個(gè)體積的一個(gè)額外瓶子與呼吸、葉綠素a和細(xì)菌計(jì)數(shù)瓶一起培養(yǎng)。樣品用盧戈?duì)柸芤汗潭ǎK濃度為2%。根據(jù)Uterm?hl方法，使用倒置顯微鏡和25毫升沉降管對(duì)浮游植物生物進(jìn)行計(jì)數(shù)和鑒定。

2.5.暗群落呼吸

暗群落呼吸通過(guò)以下兩種方法同時(shí)測(cè)定：（A）離散暗瓶培養(yǎng)后溶解氧的體外變化；（B）通過(guò)氧電極連續(xù)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)室中的氧濃度。

2.5.1.離散培養(yǎng)

使用硅膠管從50升聚乙烯桶中小心地裝滿(mǎn)三十六個(gè)經(jīng)過(guò)重量校準(zhǔn)、酸洗過(guò)的深色硼硅酸鹽玻璃瓶（每種體積：50、125和570毫升）。灌裝時(shí)讓水溢出，并特別注意硅膠管中氣泡的形成。對(duì)于每種瓶子體積，立即固定三個(gè)重復(fù)瓶子用于測(cè)定初始氧濃度，其余瓶子在恒溫室內(nèi)的溫度控制水浴中于黑暗條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度是樣品原位溫度。在各自的培養(yǎng)期后（10到12個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)），固定每種瓶子體積的三個(gè)重復(fù)瓶子。所有固定瓶子均被密封，保存在水浴中，并在固定后48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分析。溶解氧濃度通過(guò)使用Metrohm 721 DMS Titrino進(jìn)行的自動(dòng)化精密溫克勒滴定法測(cè)量，采用電位終點(diǎn)法。固定樣品的等分試樣使用10毫升溢流移液管移取。呼吸速率計(jì)算為零時(shí)樣品和培養(yǎng)樣品氧濃度平均值之差。

2.5.2.體外氧演化的連續(xù)監(jiān)測(cè)

將80毫升硼硅酸鹽呼吸室裝滿(mǎn)來(lái)自50升聚乙烯桶的海水。呼吸室用帶有毛細(xì)孔的蓋子密封，以允許氧微傳感器進(jìn)入。孔徑足夠小，以最小化室內(nèi)樣品與水浴中水之間的氧氣交換。

溶解氧測(cè)量使用Unisense微呼吸系統(tǒng)進(jìn)行，尖端內(nèi)徑為500微米。電路接地以防止電極讀數(shù)上的高頻噪聲。每次測(cè)量前，使用兩點(diǎn)程序?qū)ξ㈦姌O進(jìn)行校準(zhǔn)，以0%飽和溶解氧濃度（0.1 M抗壞血酸溶液和0.3 M NaOH溶液按50:50體積混合）和100%飽和溶解氧濃度（0.2微米過(guò)濾并劇烈鼓泡的海水）作為端點(diǎn)，在校準(zhǔn)溫度下進(jìn)行。

呼吸室放置在水下架子上，置于溫度控制水浴中，完全黑暗。在樣品制備過(guò)程中，觀(guān)察到水溫略有升高；因此，作為預(yù)防措施，由于傳感器對(duì)溫度變化高度敏感，將水浴溫度設(shè)定比原位溫度高0.2°C，從而最小化培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)可能出現(xiàn)的急劇溫度下降。

樣品浸入水浴后，將微電極插入呼吸室蓋子的毛細(xì)孔中，讀數(shù)穩(wěn)定（60-90秒）后開(kāi)始測(cè)量。氧濃度在48小時(shí)內(nèi)每20秒記錄一次。氧消耗速率確定為氧濃度隨時(shí)間下降的斜率。

使用超純水進(jìn)行的獨(dú)立測(cè)試表明，電極本身的耗氧量可以忽略不計(jì)。根據(jù)Briand等人的方法，并且由于單個(gè)微呼吸系統(tǒng)存在后勤困難，未使用重復(fù)。

由于在前兩次實(shí)驗(yàn)中獲得的信號(hào)噪聲過(guò)大，微呼吸系統(tǒng)獲得的結(jié)果未在本文中展示。在時(shí)間序列5期間，冷卻系統(tǒng)的幾個(gè)電氣問(wèn)題導(dǎo)致水浴夜間加熱；呼吸計(jì)記錄的異常氧數(shù)據(jù)被丟棄，直到水浴溫度再次達(dá)到初始溫度+0.2°C。

2.6.統(tǒng)計(jì)分析

為了評(píng)估三組瓶子體積的最小培養(yǎng)時(shí)間，進(jìn)行了非參數(shù)檢驗(yàn)U-Mann Whitney，因?yàn)橹貜?fù)次數(shù)少且方差齊性假設(shè)并非總是滿(mǎn)足。氧濃度與初始氧濃度首次出現(xiàn)顯著差異的培養(yǎng)時(shí)間被視為最小時(shí)間。呼吸速率的線(xiàn)性也通過(guò)此檢驗(yàn)確定，通過(guò)比較每個(gè)培養(yǎng)期后測(cè)得的每小時(shí)呼吸速率與最小時(shí)間測(cè)得的每小時(shí)速率。當(dāng)在某個(gè)時(shí)間的每小時(shí)呼吸速率與后續(xù)時(shí)間的速率之間檢測(cè)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著變化時(shí)，前者被視為最大培養(yǎng)時(shí)間。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，呼吸速率不是獨(dú)立的，因?yàn)樗鼈兪怯擅總€(gè)培養(yǎng)瓶的氧濃度減去初始氧濃度計(jì)算得出的。因此，為了研究三種不同瓶子大小在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中累積呼吸的差異，我們進(jìn)行了重復(fù)測(cè)量方差分析檢驗(yàn)，該檢驗(yàn)允許在隨機(jī)樣本的所有成員在相同條件下測(cè)量時(shí)檢驗(yàn)差異。

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS軟件進(jìn)行。