2.3.物種組成和生物體積測(cè)定


用于物種鑒定和細(xì)胞大小測(cè)量的HRAM培養(yǎng)物子樣品在Phyco Tech納米浮游生物室中沉淀，并在Leica DMLB顯微鏡上以高達(dá)600倍的放大倍數(shù)觀察。微藻根據(jù)John等人的分類學(xué)描述鑒定到物種水平。對(duì)于物種計(jì)數(shù)，將1 mL HRAM培養(yǎng)物沉淀在Sedgwick rafter計(jì)數(shù)室中，在200倍放大倍數(shù)下觀察并計(jì)數(shù)所有存在的微藻。使用校準(zhǔn)的目鏡測(cè)微尺進(jìn)行細(xì)胞測(cè)量。根據(jù)分配給微藻屬的特定幾何形狀和方程式估算微藻細(xì)胞（不包括刺和粘液）的生物體積。


2.4.有機(jī)物和葉綠素生物量


對(duì)于有機(jī)物，將已知體積的HRAM培養(yǎng)物通過(guò)預(yù)先沖洗、預(yù)灼燒和預(yù)稱重的Whatman GF/F過(guò)濾器過(guò)濾，在105°C烘箱中烘干，冷卻后稱重以確定總懸浮固體濃度。然后將過(guò)濾器在450°C下灼燒4小時(shí)，在干燥器中冷卻并重新稱重以確定灰分濃度。有機(jī)物，也稱為揮發(fā)性懸浮固體，估算為TSS和灰分濃度之間的差值。對(duì)于葉綠素a和葉綠素b，將已知體積的HRAM培養(yǎng)物過(guò)濾到Whatman GF/F過(guò)濾器上，將過(guò)濾器在65.5°C的100%甲醇中煮沸5分鐘，然后在4°C黑暗條件下提取12小時(shí)。然后將樣品在3000 rpm下離心10分鐘，并在Shimadzu UV-2550分光光度計(jì)上讀取上清液的吸光度。使用甲醇的三色方程估算葉綠素a和葉綠素b濃度。


2.5.營(yíng)養(yǎng)鹽和營(yíng)養(yǎng)鹽去除效率


溶解營(yíng)養(yǎng)鹽樣品通過(guò)Whatman GF/F過(guò)濾器過(guò)濾，銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和溶解性活性磷的濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法比色測(cè)定。進(jìn)水每單位微藻葉綠素a生物量去除營(yíng)養(yǎng)鹽的效率，稱為營(yíng)養(yǎng)鹽去除效率，通過(guò)以下公式確定：

NRE=[（進(jìn)水濃度-出水濃度）/葉綠素a]×[1/停留時(shí)間（天）]


2.6.高速藻池光衰減和氣候


使用連接到LiCor Li-1000量子記錄儀（Li-Cor Biosciences,Lincoln,Nebraska,USA）的LiCor 2π水下傳感器測(cè)量每個(gè)HRAM水柱的光剖面。垂直光衰減系數(shù)通過(guò)下行輻照度對(duì)數(shù)與深度的回歸計(jì)算。水下光為表面光1%的光合作用帶深度從Kd估算。細(xì)胞每天在水柱中上下移動(dòng)所經(jīng)歷的總光量計(jì)算如下：

E_mix=[100×(1-e^{-K_d Z_mix})(K_d Z_mix)^{-1}]×日表面輻照度


其中Z_mix是高速藻池深度。基于生物量采樣前4天期間的平均E_mix根據(jù)日總表面輻照度確定。日表面輻照度在鄰近的氣象站記錄。


2.7.微藻光吸收和包裝效應(yīng)


總顆粒光吸收在Shimadzu UV-2550分光光度計(jì)上使用積分球，在1 cm石英比色皿中測(cè)量，方法詳見(jiàn)Sutherland等人。微藻吸收系數(shù)aph(λ)m?1，確定為總顆粒吸收與碎屑吸收之差。單位總?cè)~綠素a的比吸收系數(shù)a*_ph(λ)m2mg?1，通過(guò)將aph(λ)除以總?cè)~綠素a計(jì)算得出。aph(675)是葉綠素a光吸收的量度，而a(440)是輔助色素和光保護(hù)色素光吸收的量度。


包裝效應(yīng)是色素細(xì)胞的葉綠素比吸收系數(shù)a與相同細(xì)胞物質(zhì)均勻分散在溶液中的比吸收系數(shù)a_sol之比。當(dāng)a與a_sol之比為1時(shí)，沒(méi)有包裝效應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)葉綠素的吸收是最佳的。當(dāng)該比率向0減小時(shí)，包裝效應(yīng)增加，光吸收是次優(yōu)的。a_sol的比吸收系數(shù)在675 nm處假定為0.0207 m2mg?1，因此Qa(675)估算為：


Qa=a_ph(675)/0.0207


然后每個(gè)培養(yǎng)物的光譜平均葉綠素a比吸收系數(shù)計(jì)算如下：


ā=[∑_{400}^{700}a_ph(λ)E(λ)]/[∑_{400}^{700}E(λ)]


其中E(λ)是Hansatech光室的光譜輸出（詳見(jiàn)下文）。


2.8.光合參數(shù)


2.8.1.葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量


使用葉綠素?zé)晒鈱?duì)輻照度響應(yīng)的快速光曲線評(píng)估CO?處理之間光合潛力的日變化。由于所需時(shí)間以及下午非常高的溶解氧濃度（>300%空氣飽和度）的干擾，全天進(jìn)行光合作用測(cè)量（氧氣產(chǎn)生）不可行。然而，使用本實(shí)驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)，對(duì)所有HRAMs中暗適應(yīng)微藻的最大電子傳遞速率和最大光合速率進(jìn)行了比較，顯示這兩個(gè)變量之間存在強(qiáng)線性關(guān)系（R2=0.9442；圖1）。在本實(shí)驗(yàn)的背景下，這種關(guān)系支持在無(wú)法測(cè)量P_max時(shí)使用ETR_max來(lái)證明光合潛力。

由于藻類濃度高、細(xì)胞沉降速率高以及避免攪拌對(duì)熒光測(cè)量的負(fù)面影響，使用潛水式PAM（Walz,Effeltrich,Germany）進(jìn)行RLCs。對(duì)于每個(gè)RLC，將1 mL樣品在環(huán)境光條件下在不透明、無(wú)反射的比色皿中沉淀1分鐘，然后進(jìn)行測(cè)量。通過(guò)將每個(gè)樣品暴露于初始暗步驟，然后八個(gè)遞增輻照度步驟，然后在每個(gè)步驟間隔結(jié)束時(shí)進(jìn)行量子產(chǎn)額測(cè)量，來(lái)進(jìn)行重復(fù)RLCs。輻照度步驟由PAM軟件程序控制，第一個(gè)輻照度步驟由用戶定義。每個(gè)輻照度步驟的間隔持續(xù)10秒，以最小化在測(cè)量過(guò)程中發(fā)生光誘導(dǎo)的可能性，并確保測(cè)量即時(shí)光合狀態(tài)。

電子傳遞速率計(jì)算如下：


ETR=(ΔF/F_m')×E×0.5×a*_ph


其中ΔF是在飽和輻照度下測(cè)量的最大熒光（F_m）減去閃光前的穩(wěn)態(tài)熒光（F_m'），E是每個(gè)步驟的輻照度，0.5是乘法因子，因?yàn)榧僭O(shè)吸收的光子有一半分配給光系統(tǒng)II。


ETR值在Sigmaplot（v11.0,SPSS Inc.）中作為PAR（根據(jù)RLC對(duì)照校準(zhǔn)的LiCor 2π傳感器測(cè)量）的函數(shù)繪制，并使用Hennige等人修改自Jassby和Platt（1976；見(jiàn)下文）的以下模型擬合曲線，以得出ETRα和ETR_max：


ETR=ETR_max×[1-exp((-ETRα×E)/ETR_max)]


其中ETRα是最大光利用效率，從初始斜率得出，ETR_max是最大電子傳遞速率。ETR_Ek，光飽和強(qiáng)度，定義為光化學(xué)效率從光限制轉(zhuǎn)變?yōu)楣怙柡偷墓馑?，從以下方程得出?


ETR_Ek=ETR_max/ETRα


每天在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)（上午7:30、上午10:30、下午1:30和下午4:30）測(cè)量RLC，以評(píng)估ETR在不同輻照度條件下的有效性。


非光化學(xué)淬滅是過(guò)量光下被消散或淬滅的入射光子能量的量度，以防止光化學(xué)途徑受損。在與RLC測(cè)量相同的時(shí)間評(píng)估NPQ的日變化。NPQ通過(guò)以下方程計(jì)算：


NPQ=(F_m-F_m')/F_m'


使用潛水式PAM的RLC+恢復(fù)功能評(píng)估光系統(tǒng)II的恢復(fù)速率。在RLC之后，通過(guò)在暗暴露10、30、60、120、300和600秒后應(yīng)用6個(gè)連續(xù)飽和脈沖來(lái)評(píng)估暗處產(chǎn)量和NPQ的恢復(fù)?；謴?fù)速率與RLC開(kāi)始時(shí)測(cè)量的初始暗適應(yīng)產(chǎn)量和NPQ值進(jìn)行比較。在所有處理組以及對(duì)照組的兩個(gè)不同pH水平（pH 9和pH 10）下測(cè)量恢復(fù)速率，因?yàn)閜H在一天中變化。


2.8.2.光合作用和最大量子產(chǎn)額


通過(guò)沿遞增輻照度梯度測(cè)量氧氣產(chǎn)生速率來(lái)確定初級(jí)生產(chǎn)力與輻照度曲線。將HRAM培養(yǎng)物等分試樣放入Hansatech氧電極室中，輻照度水平通過(guò)oxyLab32軟件程序（Hansatech Instruments Ltd.,UK）控制。使用在0%和100%空氣飽和水中校準(zhǔn)的Clark型快速響應(yīng)微傳感器（Unisense,Denmark）測(cè)量氧氣產(chǎn)生。輻照度曲線的總孵育時(shí)間為15分鐘，因?yàn)槌醪綔y(cè)量表明，當(dāng)總孵育時(shí)間超過(guò)此時(shí)，pH迅速上升，氧氣產(chǎn)生下降（數(shù)據(jù)未顯示）。在光生物反應(yīng)器藻類培養(yǎng)物中也觀察到了類似現(xiàn)象。


光合參數(shù)Pα和P_max通過(guò)使用Sigmaplot繪圖軟件（v 11.0）擬合Platt等人（1980）的公式，從重復(fù)的PE曲線估算：

P=P_max×[1-exp((-Pα×E)/P_max)]


其中Pα是PE曲線線性部分的斜率，顯示光限制條件下光合作用的效率，而P_max是PE曲線趨于平穩(wěn)的點(diǎn)，代表光飽和條件下光合作用的最大速率。PE_k，光合作用的光飽和強(qiáng)度，定義為光合作用從光限制轉(zhuǎn)變?yōu)楣怙柡偷墓馑?，從以下方程得出?


PE_k=P_max/Pα


最大量子產(chǎn)額定義了基于微藻吸收的光子能量的初級(jí)生產(chǎn)力速率。Φ_max表示每吸收光量子釋放氧分子的效率。Φ_max計(jì)算如下：


Φ_max=Pα/(43.2×ā*)

其中43.2將秒轉(zhuǎn)換為小時(shí)，毫克轉(zhuǎn)換為摩爾，微摩爾轉(zhuǎn)換為摩爾。


2.9.統(tǒng)計(jì)分析


必要時(shí)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換以消除不對(duì)稱方差。使用方差分析和線性回歸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用Statistica（v10）軟件（Statsoft Inc.,Tulsa,OK,USA）進(jìn)行。


3.結(jié)果


3.1.環(huán)境變量和溶解無(wú)機(jī)碳


在16天的培養(yǎng)期間，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中各處理組和對(duì)照組之間的HRAM溫度沒(méi)有顯著差異（表1）。在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，所有四個(gè)處理組的pH通過(guò)在白天添加CO?氣體來(lái)控制。處理組的pH值顯著低于對(duì)照組（無(wú)CO?添加），對(duì)照組的中位值分別為pH 9.3（實(shí)驗(yàn)1）和pH 9.5（實(shí)驗(yàn)2；表1）。對(duì)于兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，溶解氧飽和度變化很大，通常范圍從所有HRAMs黎明前<50%空氣飽和度到所有四個(gè)處理組黃昏時(shí)>440%和對(duì)照組>330%（表1）。對(duì)照HRAMs中的DO顯著低于所有4個(gè)處理組（p<0.01）。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，溶解無(wú)機(jī)碳濃度隨著pH降低而顯著增加（表1）。各處理HRAMs中的DIC濃度在一天過(guò)程中沒(méi)有顯著差異，然而，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組HRAMs中的DIC隨著一天中pH升高而顯著降低（表1，圖2）。

表1- 兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中高速藻池中宇宙系統(tǒng)處理組的溫度、日間pH、溶解氧（DO）飽和度和溶解無(wú)機(jī)碳（DIC）濃度。數(shù)據(jù)為日間中位數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。
參數(shù) Control (pH>9) pH 8 pH 7.5 pH 7 pH 6.5
實(shí)驗(yàn)1 溫度 (°C) 中位數(shù) ± s.d. 23.0±3.5 22.9±2.9 23.1±2.9 23.2±2.9 23.3±2.9
min/max 15.9/26.7 16.0/26.8 16.2/26.8 16.4/26.8 16.3/26.6
pH 中位數(shù) ± s.d. 9.3±0.7 8.0±0.1 7.5±0.1 7.0±0.1 6.5±0.1
min/max 8.1/10.7 7.9/8.1 7.4/7.6 6.9/7.1 6.4/6.6
DO (%) 中位數(shù) ± s.d. 192±88 260±120 307±130 313±125 281±117
min/max 28/333 45/440 54/496 52/444 50/447
DIC (mg/L) 中位數(shù) ± s.d. 154±127 456±18 551±11 675±21 978±17
min/max 23/441 421/470 537/570 649/690 963/1011
實(shí)驗(yàn)2 溫度 (°C) 中位數(shù) ± s.d. 25.8±3.1 25.5±3.3 25.2±3.6 25.5±3.8 25.6±3.8
min/max 18.9/30.5 18.7/30.2 18.9/30.4 18.8/30.4 18.7/30.7
pH 中位數(shù) ± s.d. 9.5±0.8 8.0±0.1 7.5±0.1 7.0±0.1 6.5±0.1
min/max 8.3/11.2 7.9/8.1 7.4/7.6 6.9/7.1 6.4/6.6
DO (%) 中位數(shù) ± s.d. 209±96 308±150 348±141 333±116 321±126
min/max 31/349 47/457 53/471 49/460 48/447
DIC (mg/L) 中位數(shù) ± s.d. 135±145 453±22 535±25 669±34 965±21
min/max 15/403 421/482 502/556 639/715 945/985