背景與目的

視網膜的視桿細胞外段是進行光轉導的特化細胞器。線粒體電子傳遞鏈復合物I-IV、細胞色素c以及FoF1-ATP合酶在視桿細胞外段盤膜上均有功能性表達。本研究旨在探究一些作為線粒體ATP酶/合酶抑制劑的多酚類化合物對視桿細胞外段異位FoF1-ATP合酶的作用。同時，通過研究細胞色素c、caspase 9、caspase 3以及Apaf-1的表達，探討了視桿細胞外段中的細胞凋亡機制。

實驗方法

我們從新鮮牛視網膜中制備了視桿細胞外段。采用了半定量Western blotting、共聚焦和電子顯微鏡、細胞流式術以及生化分析（如測氧法、ATP合成與水解測定）等方法。

主要結果

白藜蘆醇以及姜黃素聯合胡椒堿抑制了視桿細胞外段中的ATP合成和耗氧量。表沒食子兒茶素沒食子酸酯和槲皮素抑制了視桿細胞外段中的ATP水解和耗氧量。在有底物存在的情況下，呼吸中的視桿細胞外段會產生丙二醛和過氧化氫。細胞色素c定位于盤膜內部。Procaspase 9、procaspase 3以及Apaf-1在視桿細胞外段中均有表達。

結論與意義

這些多酚類植物化學物質通過調節視桿細胞外段的FoF1-ATP合酶活性，減少了由視桿細胞外段異位電子傳遞鏈產生的活性氧中間體。多酚類物質能減少膜過氧化和細胞色素c從盤膜中的釋放，從而阻止視桿細胞外段中caspase依賴性細胞凋亡的誘導。這些效應對于設計針對因暴露于強光照射導致氧化應激后視桿細胞外段功能損傷的保護策略具有重要意義。

縮寫

AMD，年齡相關性黃斑變性；Ap5A，二（腺苷）-5'-五磷酸；ATP合酶，FoF1-ATP合酶；CLSM，共聚焦激光掃描顯微鏡；Cyt c，細胞色素c；DR，糖尿病視網膜病變；EGCG，表沒食子兒茶素沒食子酸酯；ETC，電子傳遞鏈；OS，外段；PUFA，多不飽和脂肪酸；ROI，活性氧中間體；RP，視網膜色素變性；TEM，透射電子顯微鏡。

引言

氧化應激是視網膜退行性疾病發病機制中的一個主要因素，包括與光感受器相關的病變，如年齡相關性黃斑變性和糖尿病視網膜病變。由于視網膜具有比其他組織更高的代謝率，光感受器消耗的氧氣大約是其他視網膜或中樞神經系統細胞的四倍，因此氧氣對于光感受器的存活至關重要。暗適應的外層視網膜有高水平的氧氣利用。這與我們之前的蛋白質組學和生化分析結果一致，即分離的視桿細胞外段盤膜中表達并具有異位FoF1-ATP合酶、電子傳遞鏈和細胞色素c的活性。視桿細胞外段本身可能是外層視網膜高耗氧量的原因。最近的數據顯示，短波長光（藍光）照射誘導的氧化應激對視桿細胞外段的影響大于對光感受器內段的影響，這強化了這一觀點。不僅是含有線粒體的內段，視桿細胞外段也是介導藍光誘導細胞毒性的活性氧中間體的來源。電子傳遞鏈是活性氧中間體的主要來源，并且視桿細胞外段膜脂質易于氧化，因為它們含有非常高含量的多不飽和脂肪酸。當多不飽和脂肪酸被氧化時，會引發細胞毒性氧化還原鏈式反應，導致活性氧中間體產生和氧化應激。

已知盤膜通過細胞凋亡死亡，但其成因尚不明確。觸發caspase介導的細胞凋亡的一條通路是凋亡小體的形成，涉及細胞色素c對caspase 9的激活及其與胞質Apaf-1的結合。我們之前的蛋白質組學分析顯示，細胞色素c在盤膜中表達，并且盤膜中的ATP合酶是朝外取向的。考慮到細胞色素c的朝向與ATP合酶F1部分的朝向相反，這提出了一個可能性：任何由于電子傳遞鏈功能過度活躍導致的盤膜暴露于氧化應激，都可能允許細胞色素c從盤膜內腔逸出。

一些多酚類植物化學物質是顯示強效抗氧化作用的天然化合物。它們也作為ATP合酶抑制劑發揮作用。線粒體ATP合酶顯示兩個功能結構域。F1，一個由五個亞基組成的水溶性催化復合物，催化位點位于β亞基上；以及Fo，由幾種膜蛋白組成，因此包含寡霉素敏感性賦予蛋白。當質子順其濃度梯度流動時，Fo的c亞基環順時針旋轉驅動ATP合成。逆時針移動時則執行ATP水解（ATP酶活性）。由于其復雜的結構，ATP合酶被許多不同的天然和合成抑制劑所抑制。天然抑制劑是F1的蛋白質抑制劑，一種在去能條件下結合F1的堿性蛋白，旨在保存細胞ATP。外源性ATP合酶抑制劑已被描述，包括efrapeptin、寡霉素、金擔子素B和疊氮化物。靶向F1的抑制劑efrapeptin的結合口袋位于α和β亞基，而金擔子素B的結合口袋主要在β亞基。

白藜蘆醇是一種天然的芪類植物抗毒素，是靶向F1組分的ATP合酶抑制劑。它通過結合在α和β亞基之間來影響ATP酶和ATP合酶活性。一類由植物產生的類黃酮相關多酚化合物，黃酮類，包括槲皮素、山奈酚、桑色素和芹菜素，也抑制線粒體ATP合酶的ATP水解活性，但不抑制ATP合成活性。山奈酚、桑色素和芹菜素對ATP酶活性的抑制作用與槲皮素相似，盡管后者的抑制效力約為前者的一半。兒茶素是另一類在綠茶中含量豐富的多酚化合物，包括表兒茶素、表沒食子兒茶素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯。后兩者是ATP水解的抑制劑。表沒食子兒茶素沒食子酸酯具有極強的抗氧化特性。姜黃素是印度咖喱香料中的活性成分，是一種從姜黃中提取的多酚，這種香料在南亞食品中廣泛使用。它也作為F1催化頭部的抑制劑發揮作用。

在此，我們報道白藜蘆醇、姜黃素、槲皮素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯抑制在視桿細胞外段中表達的異位ATP合酶，影響其ATP酶或ATP合酶活性或兩者。它們也抑制視桿細胞外段的耗氧量。這似乎與視桿細胞外段表達功能性ATP合酶的假說一致，也與這些化合物對許多視網膜病變產生的有益效應一致。我們還在盤膜內部發現了細胞色素c，并在視桿細胞外段中發現了procaspase 9、procaspase 3和Apaf-1。