方法

富氫水和 DMEM 培養基的制備

富氫水是通過將 H2 在 0.4 MPa 壓力下溶解于水中飽和 6 小時，使用氫氣水裝置（由上海一泉投資有限合伙企業提供，中國上海）產生的，濃度為 1.0 ppm。該富氫水含有 400-1800 ppb 納米顆粒，以及在此適當濃度下 -650 mV 的氧化電位，不易在水中蒸發或坍塌，因此可以比氫顆粒更穩定地向細胞和組織供應氫氣。富氫水每周新鮮制備一次，在常壓 4°C 下儲存在無死體積的鋁袋中，H2 濃度為 0.6 mmol/L。

接下來，我們特別配制了氫化 DMEM 培養基（H-CM），其中包含28毫升無菌氫化水（1.0 ppm）、8毫升5X DMEM 、4毫升10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素G以及100 μg/mL鏈霉素，該溶液中含0.7 ppm的雙原子氫（H2），并將其置于無菌離心管中。培養基每日新鮮配制，使用前需在4°C常壓條件下保存。對于PBS中溶解分子氫的濃度測定，我們采用氫氣電極（丹麥unisense公司）作為主要測量設備。將一根5微米含氫電極插入H-CM中進行H2濃度測量。

細胞培養

Ishikawa 細胞系自 2017 年 10 月起在我院（上海交通大學醫學院附屬上海市第一人民醫院）實驗室培養，目錄號：GCC-UT0004RT/CS。HEC1A 細胞系于 2016 年 1 月購自中國科學院細胞庫，目錄號：TCHu149。AN3CA 細胞系于 2016 年 3 月購自 ATCC，目錄號：ATCC HTB-111。上述所有細胞系最近均檢測無支原體污染，并按照 ATCC 標準發展組織（SDO）2012 年 ANSI 標準（ASN-0002）和 Capes-Davis 的參考文獻中所述，使用短串聯重復（STR）分析進行了鑒定，GENECHEM 遵循 ISO 9001:2008 和 ISO/IEC 17025:2005 質量標準，使用 GeneMapper 軟件 5 進行 STR 分析。所有細胞系的使用均獲得了上海交通大學醫學院附屬上海市第一人民醫院人類研究倫理委員會的批準。細胞在 DMEM:F12 中培養 24 或 48 小時：含有 10% FBS、100U/mL 青霉素 G 和 100μg/mL 鏈霉素，在 37°C、5% CO2 的濕潤氣氛中培養。

分泌期子宮內膜標本取自 2018 年 10 月因異常子宮出血在我院行刮宮術的 3 例患者。對于原代人類子宮內膜腺細胞培養，將 3 至 5 克子宮內膜組織刮取并置于含有雙抗生素（青霉素 100 U/ml + 鏈霉素 100 U/ml）和甲硝唑的 DMEM:F12 無菌收集管中。然后用 D-Hank's 溶液、雙抗生素、100U/ml 甲硝唑洗滌組織 3 次，浸泡 5 分鐘后加入細胞培養液，在超凈操作下去除紅細胞；接下來，將組織切成 2~3 mm3 小塊，用 0.1% 胰蛋白酶-EDTA 在 37°C 下消化 30 分鐘，每 10 分鐘搖動一次；過濾溶液并加入 400 目（38 孔）篩網去除粘液、未消化的組織、上皮細胞和間質細胞。以 1000 rpm 離心 10 分鐘，棄去上清液。最后，將子宮內膜腺細胞重懸并培養于含有 10% FBS 的 DMEM:F12 中，置于 37°C、相對體積分數為 5% CO2 的培養箱中使用。

子宮內膜癌細胞及原代人子宮內膜腺細胞系均與新鮮人臍帶血培養基（H-CM）共培養24小時或48小時，以確保細胞處于良好狀態。每次后續功能實驗前約20分鐘，再次更換新鮮H-CM以維持培養基中氫氣（H2）的持續濃度。每次功能實驗開始時采用氫氣微電極測定培養基中的H2含量。

免疫組織化學染色

我們從 2018 年 5 月至 11 月在我院因子宮切除術或刮宮術獲得的子宮內膜癌（n=16）、非典型增生（n=3）和良性分泌期子宮內膜組織（n=6）中檢索樣本，我們的研究方法獲得了上海交通大學醫學院附屬上海市第一人民醫院人類研究倫理委員會的批準。我們尊重人類受試者的隱私權。研究中的所有參與者均確認并簽署了關于個人可識別數據（包括生物醫學、臨床和生物特征數據）形式的同意書。實驗符合赫爾辛基宣言。

處死小鼠后取出異種移植腫瘤組織。通過頸椎脫臼處死小鼠后，隨機檢查子宮內膜標本。對于免疫組織化學（IHC）分析，組織經福爾馬林固定并石蠟包埋。煮沸后在檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中進行抗原修復，與 0.01% Triton-X100 孵育 30 分鐘，與 5% 牛血清白蛋白孵育 20 分鐘。加入抗兔 NLRP3（1:200）、抗人 caspase-1（1:200）、抗人 GSDMD（1:100）或抗人 IL-1β（1:200）一抗，在潮濕室中 4°C 過夜，與生物素化二抗共孵育 50 分鐘。對于免疫組織化學的定量分析，使用顯微成像分析系統觀察和分析斑塊圖像。免疫組織化學染色根據陽性細胞比例（0 分：0%，1 分：≤10%，2 分：11-50%，3 分：51-80%，4 分：≥80%）和染色強度（0 分：陰性，1 分：弱，2 分：中等，3 分：強）進行評分，最終導致表達完全缺失，或弱、中、強表達。

蛋白質印跡分析

使用 RIPA 緩沖液裂解和提取總蛋白。細胞蛋白在 SDS-聚丙烯酰胺微型凝膠上分離，并轉移到 PVDF 膜上，在 300 mA 下電泳 1.5 小時。使用的一抗包括抗兔 NLRP3（1:1000）、抗小鼠 ASC（1:1000）、抗人 caspase-1（1:1000）、抗人 GSDMD（1:1000）和抗人 IL-1β（1:1000）孵育 30 分鐘。用 5% BSA 封閉膜 1 小時，加入一抗在 4°C 過夜。二抗（1:5000）與膜在室溫下孵育 1 小時，隨后用 Tris 緩沖鹽水（TBST）洗滌三次。使用 ECL 化學發光和 Image 軟件進行可視化和定量。

MTT 檢測

通過 MTT 檢測分析細胞活力。轉染后 24 小時，將子宮內膜癌細胞與 20μl 5mg/ml MTT（3-4,5-二甲基噻唑-2-基-2,5-二苯基溴化四唑）試劑在 96 孔板中于 37°C 孵育 4 小時，每孔約 2000 個細胞。從每個孔中移除培養基后，用 100μl 二甲基亞砜（DMSO）溶解孔中的甲臜顆粒，用分光光度計在 490 nm 處測量吸光度。每個實驗進行三次重復。

細胞內 ROS 水平的測量

通過二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）方法染色細胞測定總細胞內活性氧（ROS）。細胞與 10μM DCFH-DA 在 37°C 孵育 20 分鐘，與 100μL 細胞裂解液充分混合。每份 150μL 裂解物混合物在室溫下孵育 5 分鐘，并轉移到單獨的 96 孔板中，使用熒光顯微鏡在 485 和 500 nm 激發和發射波長下進行測量。