焦亡相關(guān)蛋白 NLRP3、caspase-1 和 GSDMD 在富氫水飲用異種移植小鼠模型的子宮內(nèi)膜癌組織中過表達

接下來，我們探討了氫氣誘導(dǎo)的焦亡通路是否影響體內(nèi)子宮內(nèi)膜腫瘤發(fā)生。盡管 HRW 和 NC 組的腫瘤組織切片均呈現(xiàn) NLRP3（圖 8a）、caspase-1（圖 8b）和 GSDMD（圖 8c）的中等至強陽性表達，但 HRW 組通過 IHC 顯示染色更強。這些觀察表明，氫氣通過焦亡途徑減弱了異種移植小鼠模型中的腫瘤體積和重量。

圖8：在異種移植小鼠模型中，富氫水處理上調(diào)了腫瘤組織內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白的表達。通過免疫組織化學(xué)（IHC）檢測（a）NLRP3、（b）Caspase-1 和（c）GSDMD 在富氫水（HRW）組和正常對照（NC）組小鼠腫瘤組織中的表達。（原始放大倍數(shù)，×400；比例尺，20μm）。柱狀圖顯示了基于染色強度和陽性細胞比例的 IHC 評分量化分析。數(shù)據(jù)表示為均值 ± 標準差。*P < 0.05，與 NC 組比較。

討論

具有特定病理類型（如漿液性癌）或具有高風險因素（如遠處轉(zhuǎn)移或深肌層浸潤）的子宮內(nèi)膜癌可能對放療/化療不敏感，因為其對凋亡和壞死具有抵抗性；因此，焦亡性死亡可能是子宮內(nèi)膜癌的另一種靶向治療方法。根據(jù) TCGA 數(shù)據(jù)庫，GSDMD 蛋白表達在子宮內(nèi)膜癌和正常子宮內(nèi)膜組織之間存在顯著差異，并且與病理類型、分期和患者體重相關(guān)。最近的研究表明，焦亡是自身炎癥和自身免疫性疾病的特征；我們發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌病變中存在焦亡現(xiàn)象，表現(xiàn)為 NLRP3、caspase-1、GSDMD 和 IL-1β 的高表達，這通過 IHC 分析得以鑒定。

凋亡、壞死性凋亡和焦亡是宿主細胞中不同的細胞死亡過程。凋亡是 caspase-3/7/8/9 介導(dǎo)的基因調(diào)控的程序性細胞死亡，而壞死性凋亡是一種促炎癥和非 caspase 介導(dǎo)的細胞死亡過程。相比之下，焦亡由炎癥小體和 caspase-1/4/11 介導(dǎo)，這些在巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞等免疫細胞中發(fā)現(xiàn)，并在清除細胞內(nèi)細菌中起關(guān)鍵作用（表 2）。焦亡和凋亡之間存在一些其他差異。首先，焦亡細胞的核形態(tài)導(dǎo)致 DNA 損傷，但不一定能觀察到 DNA 梯狀條帶。此外，TUNEL 檢測在焦亡期間顯示陽性。其次，焦亡細胞對 annexin V 染色呈陽性，annexin V 與通常限制在細胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸結(jié)合。因此，可以檢測到 PI 染色的焦亡細胞。第三，焦亡中球形膜孔形成的額外結(jié)果是細胞腫脹。這些突起的持續(xù)快速腫脹后，細胞質(zhì)內(nèi)容物結(jié)合、破裂并釋放到細胞外空間，這通常可以通過檢測 LDH 來測量。焦亡和凋亡途徑也通過炎癥性和凋亡性 caspase 之間的直接相互作用聯(lián)系起來，并且目前認為 GSDMD 蛋白中的兩個切割位點是決定受感染細胞進展為焦亡或凋亡的檢查點。

尋找激活子宮內(nèi)膜癌焦亡的高效且安全的臨床應(yīng)用極為重要。由于 ROS 是參與細胞焦亡的上游機制，并且子宮內(nèi)膜癌中的 ROS 濃度高于正常子宮內(nèi)膜組織，我們假設(shè)升高的 ROS 將導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌細胞中焦亡激活細胞死亡。研究人員越來越多地接受 H2 氣體或富氫鹽水作為癌癥治療方法中有前景的候選者。H2 是空氣中的安全成分，濃度低于 4.7%，并且能快速穿透生物膜；然而，H2 的半衰期為 0-2 小時，幾乎在 8 小時內(nèi)消失。我們的研究表明，用氫氣刺激的子宮內(nèi)膜細胞可以導(dǎo)致細胞和線粒體生成 ROS（P<0.05），這已被證明會觸發(fā) NLRP3 激活。

由 NLRP3 炎癥小體引起的炎癥反應(yīng)在各種對宿主構(gòu)成威脅的情況下被觸發(fā)，包括 TNF-α、NF-κB 通路和 ROS。在我們之前的工作中，我們證明了氫氣處理激活了子宮內(nèi)膜癌細胞中的 TNF-α 和 NF-κB 通路。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與良性組織相比，子宮內(nèi)膜癌組織中 NLRP3 炎癥小體（包括 NLRP3 和 caspase-1 表達）上調(diào)（表 1，圖 2）。基于我們的發(fā)現(xiàn)，氫氣處理增加了子宮內(nèi)膜癌細胞中焦亡相關(guān)蛋白 NLRP3、ASC、pro-caspase-1 和 caspase-1 的表達（圖 3），并且氫氣處理的細胞表現(xiàn)出更高比例的 PI 陽性和 TUNEL 陽性細胞，我們提出 DNA 斷裂引起的焦亡是由 ROS 和 NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的（圖 4、5 和 6）。

然而，我們需要進一步確定氫氣激活的焦亡在子宮內(nèi)膜癌中的關(guān)鍵作用。闡明這方面將促進對經(jīng)典 GSDMD 觸發(fā)焦亡的詳細機制有更深入的理解。GSDMD 是一種內(nèi)源性成孔蛋白，其啟動需要激活劑。我們證明了 H2 激活了 ROS-NLRP3-caspase-1，從而誘導(dǎo)了 GSDMD 依賴性焦亡（圖 6）。因此，我們的發(fā)現(xiàn)引發(fā)了確定 H2 在子宮內(nèi)膜癌細胞中激活 GSDMD 是否最終觸發(fā)焦亡的興趣。經(jīng)典的 GSDMD 介導(dǎo)的焦亡包括三個關(guān)鍵步驟。首先，caspase-1 切割 GSDMD，切下 p20 片段 C 末端 GSDMD（GSDMDcterm）并形成功能性的 p30 片段 N 末端結(jié)構(gòu)域（NTD）GSDMD（GSDMDNterm）。其次，GSDMD 將其 NTD 插入質(zhì)膜并與之結(jié)合。第三，GSDMDNterm 創(chuàng)建質(zhì)膜孔，內(nèi)徑為 10-20 nm；這是焦亡的關(guān)鍵步驟。GSDMD 的 p30 片段以高階寡聚體形式存在并形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可通過負染電子顯微鏡觀察到。這些結(jié)構(gòu)在 GSDMD 切割后幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)，并從預(yù)載的脂質(zhì)體中釋放 Ca2+。質(zhì)膜孔形成后，GSDMD 觸發(fā)鉀離子外流，并導(dǎo)致腫脹、膜破裂、細胞內(nèi)容物釋放、核染色質(zhì)凝聚、DNA 斷裂和片段化的過程，從而釋放 IL-1β 和 IL-18。阻止 GSDMD 誘導(dǎo)的鉀離子外流似乎可以阻斷焦亡細胞殺傷。我們觀察到，在氫氣處理的子宮內(nèi)膜癌細胞中，LDH 和 IL-1β 的釋放增加，這些釋放被 LPS 和尼日利亞菌素上調(diào)，或被 ROS、NLRP3 或 caspase-1 抑制劑下調(diào)（圖 6）。為了闡明人類 GSDMD 在細胞焦亡中作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，我們研究了人類 GSDMD 蛋白的 N 末端結(jié)構(gòu)域。沉默 GSDMD 導(dǎo)致 LDH 和 IL-1β 釋放水平降低，表明 GSDMD 通過細胞裂解誘導(dǎo)死亡。當 GSDMD 被敲低時，氫氣處理和正常培養(yǎng)處理組之間沒有顯著差異。因此，GSDMD 可能是參與子宮內(nèi)膜癌焦亡的終末蛋白。我們的數(shù)據(jù)表明，在子宮內(nèi)膜癌細胞中，GSDMD 在 LPS 和尼日利亞菌素引發(fā)后被募集到 NLRP3 炎癥小體，并且 GSDMD 是 NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)焦亡和 IL-1β 產(chǎn)生所必需的（圖 6）。因此，我們將這些允許氫外流的 GSDMD 介導(dǎo)的膜孔稱為“氫通道”。后一種觀察表明，氫氣發(fā)揮其保護作用對抗子宮內(nèi)膜癌可能存在幾種潛在機制。

在本研究中，我們探討了氫氣對子宮內(nèi)膜癌的影響，并首次提供了證據(jù)表明氫氣通過 ROS-NLRP3-caspase-1 途徑誘導(dǎo)焦亡。我們證明，飲用富氫水減少了異種移植小鼠模型中子宮內(nèi)膜腫瘤的體積和重量。具體而言，使用熒光定量分析，接受富氫水（HRW）的小鼠在 12 天后顯示出 ROI 下降，表明飲用富氫水降低了腫瘤密度（圖 7）。這表明飲用 H2 水可有效治療子宮內(nèi)膜癌。HRW 組的腫瘤組織切片通過 IHC 顯示 NLRP3、caspase-1 和 GSDMD 染色更強（圖 8）。

結(jié)論

總的來說，我們的結(jié)果表明，氫氣啟動了 GSDMD 通路介導(dǎo)的焦亡，這種模式可以進一步發(fā)展作為 GSDMD 靶向治療的增敏劑。因此，氫氣可能通過炎癥依賴性細胞死亡機制對子宮內(nèi)膜發(fā)揮作用。然而，我們的研究在子宮內(nèi)膜癌患者和異種移植小鼠模型的樣本量方面存在局限性。重要的是，未來的研究應(yīng)旨在通過串聯(lián)質(zhì)譜標簽（TMT）方法分析 HRW 和 NC 組異種移植小鼠模型的腫瘤組織切片，以探索 GSDMD 和氫氣激活的焦亡在子宮內(nèi)膜癌中的作用。