摘要：通過跟蹤耗氧速率、電子自旋共振光譜檢測(cè)到的自由基形成以及抗氧化化合物亞硫酸鹽和硫醇的濃度，研究了啤酒儲(chǔ)存早期階段發(fā)生的自由基介導(dǎo)的反應(yīng)。添加 Fe(III) 或 Fe(II) 具有相似的效果，表明啤酒中這兩種物質(zhì)之間可快速達(dá)到氧化還原平衡。鐵與過氧化氫的組合添加引起了最顯著的氧化水平，這是由于通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，直接引發(fā)了乙醇氧化。亞硫酸鹽濃度的下降幅度大于硫醇濃度，這表明硫醇作為抗氧化劑主要發(fā)揮次要作用，主要通過清除乙醇氧化過程中產(chǎn)生的中間體1-羥乙基自由基。升高溫度對(duì)耗氧速率的影響較小。

引言

啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性密切相關(guān)，因?yàn)樵S多不良的異味是在儲(chǔ)存過程中通過氧化過程產(chǎn)生的。此外，負(fù)責(zé)新鮮風(fēng)味特征和苦味的化合物，例如酒花衍生的異-α-酸，會(huì)因氧化而降解。特別是淡色啤酒通常具有細(xì)膩的香氣特征，很容易因氧化而改變，因?yàn)閮?chǔ)存過程中形成的老化味物質(zhì)具有非常低的風(fēng)味閾值。在啤酒中，痕量的鐵和銅催化大氣中氧氣的初始活化以及隨后不同活性氧物種的形成，從而導(dǎo)致啤酒中的氧化損傷。過氧化氫，H2O2，是啤酒中形成的一種重要的活性氧物種，它可以與低價(jià)態(tài)的鐵和銅，F(xiàn)e(II) 和 Cu(I)，反應(yīng)，通過芬頓反應(yīng)（反應(yīng)1）生成高反應(yīng)活性的羥基自由基。

Fe2+ + H2O2 + H+ → Fe3+ + ?OH + H2O    (1)

?OH + CH3CH2OH → H2O + CH3?CH(OH)    (2)

CH3?CH(OH) + O2 → CH3CH(OH)OO? → CH3CHO + HOO?    (3)

羥基自由基以接近擴(kuò)散控制的速率與大多數(shù)有機(jī)化合物反應(yīng)，因此幾乎沒有選擇性。由于乙醇是啤酒中除水之外含量最豐富的成分，羥基自由基將優(yōu)先與乙醇反應(yīng)生成1-羥乙基自由基（反應(yīng)2）。進(jìn)一步與氧氣反應(yīng)導(dǎo)致形成1-羥乙基過氧自由基，其分解形成乙醛和氫過氧自由基（反應(yīng)3）。當(dāng)濃度足夠時(shí)，乙醛的形成會(huì)產(chǎn)生類似碰傷蘋果、雪利酒和/或堅(jiān)果的異味，從而影響啤酒的風(fēng)味。反應(yīng)1-3中所示的自由基都能夠與啤酒中的其他成分（如蛋白質(zhì)、多酚和酒花衍生化合物）發(fā)生反應(yīng)。這些副反應(yīng)將導(dǎo)致渾濁的形成以及苦味的喪失，因此會(huì)對(duì)啤酒質(zhì)量產(chǎn)生直接的負(fù)面影響。因此，詳細(xì)了解啤酒復(fù)雜的氧化機(jī)制對(duì)于實(shí)現(xiàn)良好的氧化穩(wěn)定性和充分利用啤酒中潛在的內(nèi)源性抗氧化劑至關(guān)重要。

淡色啤酒通常含有亞硫酸鹽，它是由酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的，并且是啤酒中一種有效的抗氧化劑，通過與 H2O2 發(fā)生非自由基反應(yīng)來去除它，在 pH 4.2 條件下的二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)約為 103 M-1 s-1。亞硫酸鹽作為啤酒中抗氧化劑的效率，即啤酒的氧化穩(wěn)定性，可以通過在 60°C 下強(qiáng)制老化并結(jié)合自旋捕獲和電子自旋共振光譜測(cè)定自由基的形成來評(píng)估。在淡色啤酒中，通常在初始滯后期后觀察到自由基的加速形成，并且該滯后期長(zhǎng)度已被發(fā)現(xiàn)與亞硫酸鹽濃度相關(guān)。強(qiáng)制老化過程中檢測(cè)到的自由基是1-羥乙基自由基，這些自由基主要在 H2O2 與芬頓反應(yīng)中的 Fe(II) 反應(yīng)時(shí)形成，即當(dāng)亞硫酸鹽耗盡后，繼之以乙醇與羥基自由基之間的反應(yīng)（反應(yīng)2）。含硫醇的蛋白質(zhì)也被認(rèn)為通過在啤酒中催化去除 H2O2 而起到抗氧化劑的作用，但蛋白質(zhì)硫醇在啤酒中作為抗氧化劑的確切作用機(jī)制尚未闡明。硫醇濃度已被發(fā)現(xiàn)與ESR光譜測(cè)得的滯后期相關(guān)，并且含硫醇的啤酒蛋白脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白1已被證明具有高自由基清除能力。

本研究旨在主要通過跟蹤耗氧速率，研究啤酒中早期氧化過程階段的反應(yīng)機(jī)制。氧氣是氧化反應(yīng)中的核心反應(yīng)物，因此消耗的氧氣量是氧化總程度的極好度量。然而，盡管該技術(shù)已成功用于葡萄酒氧化機(jī)制的機(jī)理研究，但迄今為止尚未用于啤酒氧化反應(yīng)的機(jī)理研究。本研究的重點(diǎn)是表征對(duì)金屬催化氧化反應(yīng)中自由基形成至關(guān)重要的化合物之間的相互作用。這包括通過ESR檢測(cè)中間自由基的研究，以及啤酒中亞硫酸鹽和硫醇的抗氧化特性的表征。

材料與方法

化學(xué)品。 ThioGlo 1熒光硫醇試劑購自Berry & Associates, Inc.。乙腈、谷胱甘肽、FeSO4·7H2O, H2O2、N-叔丁基-α-硝酮、1-辛醇、鹽酸和2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基購自Sigma-Aldrich。三羥甲基氨基甲烷、Fe2(SO4)3·H2O、三氟乙酸和抗壞血酸鈉購自Merck。亞硫酸鈉購自J.T. Baker。所有化學(xué)品均為分析純或最高純度。水通過Milli-Q純水系統(tǒng)純化。

從當(dāng)?shù)爻匈徺I全麥比爾森啤酒，在 4°C 避光儲(chǔ)存。所有瓶子來自同一生產(chǎn)批次，重復(fù)分析使用不同的瓶子進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前，將 150 mL 啤酒在藍(lán)蓋瓶中攪拌 5 min 以脫氣。通過加入 15 μL 1-辛醇防止過度起泡。

啤酒的強(qiáng)制老化。 強(qiáng)制老化通過在升高溫度下孵育啤酒或添加芬頓試劑（單獨(dú)或組合添加不同濃度的 Fe(II) 或 Fe(III) 和 H2O2）進(jìn)行。所有試劑每日新鮮配制。具體條件和濃度在每個(gè)圖的圖注中給出。