摘要： 鈷肟是流行的析氫分子催化劑，但迄今為止主要在非水條件下進行研究。我們在此表明，它們對于設計用于中性水溶液的人工氫化酶也具有價值，并報告了通過將兩個鈷肟部分，{Co(dmgH)2} 和 {Co(dmgBF2)2}（dmgH2 = 二甲基乙二肟），結合到脫輔基抹香鯨肌紅蛋白（SwMb）上，制備兩種明確的生物雜交物種。所有光譜數據都證實鈷肟部分被插入到 SwMb 蛋白的結合口袋內，并與鈷復合物的軸向位置上的一個組氨酸殘基配位，從而形成熱力學穩定的復合物。量子化學/分子力學對接計算表明，與附近存在的另一個組氨酸殘基（His64）相比，對 His93 有配位偏好。有趣的是，鈷中心的氧化還原活性在這兩種生物雜交物中都得以保留，這使它們具有在近中性水條件下析氫的催化活性。

引言

氫化酶催化質子可逆還原為分子氫。它們在熱力學平衡下發揮作用，并顯示出非常高的轉換頻率，從而使它們作為獨特的有效分子催化劑在與鉑金屬競爭 H2/H+ 相互轉換方面具有競爭力。由于它們的活性位點僅包含地球儲量豐富的第一行過渡金屬，例如鐵和鎳，在過去二十年中已經報道了許多用于析氫的仿生和生物啟發合成催化劑。特別是，鈷肟和二亞胺-二肟鈷配合物已被證明是非水介質中最活躍的析氫催化劑之一。

很少有研究探討這類催化劑在完全水相條件下的活性。總的來說，分子鈷基催化劑如鈷肟或二亞胺-二肟鈷配合物在 pH 7 時似乎不是很活躍，我們最近表明，它們在 pH 7 的磷酸鹽水性緩沖液中周轉過程中會轉化為鈷基納米顆粒。穩定這些催化劑以用于中性水介質的一種可能途徑是通過更好地控制活性中心的直接環境。最近，所謂的“人工酶”形式中的金屬蛋白帶來了靈感。事實上，在金屬酶中，多肽框架控制溶劑的接近性，并為活性位點提供低介電常數和極性的周圍環境，從而既調節其催化活性，又保護其免受不希望的分解反應。人工酶，其中一個分子合成催化劑被嵌入一個精心選擇的肽或蛋白質中，最近被證明在水中具有催化活性。有趣的是，[Co(dmgH)2(py)Cl]（dmgH2 = 二甲基乙二肟）與光系統 I 的疏水自組裝產生了一種能夠光驅動 H2 生產的雜化復合物。

圖 1. 用于本研究的鈷肟配合物和抹香鯨肌紅蛋白（SwMb）的表示。蛋白質的帶狀圖（PDB ID: 1UPD）顯示了血紅素結合口袋中的兩個組氨酸殘基（His64 和 His93）。

這些有希望的結果促使我們構建基于鈷肟的人工氫化酶，即二氟硼烷橋連的鈷肟 [Co(dmgBF2)2(H2O)2]（1）和質子橋連的鈷肟 [Co(dmgH)2(H2O)2]（2）。選擇抹香鯨肌紅蛋白（SwMb）作為宿主蛋白，因為它能夠通過金屬離子在軸向位置上與位于其疏水腔中的適當組氨酸殘基（His93）配位來結合幾種平面正方形配合物（包括其天然輔因子，血紅素）。我們在此報告兩種能夠催化析氫的鈷肟-SwMb 生物雜交物 SwMb·1 和 SwMb-2 的制備以及生化和光譜表征。

實驗部分

材料

血紅素、EuCl2、（乙二醇）雙（2-氨基乙基醚）-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）和 Nafion 溶液（5% 乙醇溶液）購自 Sigma-Aldrich。[Co(dmgH)2(H2O)2] 和脫氮黃素（DAF）根據報道的程序制備。商業級 C100 多壁碳納米管（MWCNTs；>95%）購自 Nanocyl。S-（2,2,5,5-四甲基-2,5-二氫-1H-吡咯-3-基）甲基甲磺硫代酸鹽自 Reanal Private Ltd.（布達佩斯，匈牙利）購買。

重組抹香鯨肌紅蛋白（SwMb）在大腸桿菌中的生產和純化根據報道的程序進行，并作了一些修改。在該程序中，脫輔基-SwMb 通過將包涵體重溶于 0.1% 三氟乙酸水溶液中，然后依次對 20 mmol L-1 Tris-醋酸鹽（pH 5.0）和 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.5）溶液進行兩次透析獲得（每一步通過離心去除沉淀的蛋白質）。進一步的純化通過使用用 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 8.0）和 20 mmol L-1 NaCl 緩沖液平衡的 Superdex 75 Hiload 16/60 Prepgrade 柱進行凝膠過濾（尺寸排阻色譜）。紫外-可見光監測的滴定證實純化的蛋白質完全用 1 當量的血紅素重建。

物理測量

紫外-可見光譜使用 Shimadzu UV-1800 分光光度計在石英或塑料比色皿（1 cm 光程）中記錄。圓二色性（CD）測量使用 Jasco J-810 光譜儀進行。電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）鈷滴定在格勒諾布爾大學醫院中心生物化學、毒理學和藥理學系進行。電感耦合等離子體原子發射光譜（ICP-AES）鈷滴定在阿貢國家實驗室使用 Thermo Scientific iCAP 600 光譜儀進行，誤差在 5% 以內。蛋白質濃度通過玫瑰紅滴定法確定（使用牛血清白蛋白作為標準）。

連續波（CW）X 波段（9 GHz）電子順磁共振（EPR）實驗使用兩臺不同的儀器獲得：（i）配備 Oxford ESR 910 低溫恒溫器的 Bruker EMX 光譜儀用于低溫研究（微波頻率用頻率計數器測量，磁場用 NMR 高斯計測量）；（ii）Bruker ELEXSYS E580 EPR 光譜儀（Bruker Biospin，萊茵斯特滕，德國），配備 TE102 矩形 EPR 共振腔（Bruker ER 4102st）和氦氣流低溫恒溫器（Air Product，阿倫敦，賓夕法尼亞州）。溫度由 Lakeshore 低溫溫度控制器（韋斯特維爾，俄亥俄州）控制，大約為 5 或 80 K。CW 實驗中使用的場調制導致導數型線形。高頻 EPR 測量在阿貢國家實驗室使用自制的 D 波段（130 GHz）光譜儀進行，配備單模 TE011 圓柱形腔。樣品的高頻 EPR 光譜以脈沖模式記錄，以消除由于快速通過效應引起的微波相位失真。通過監測雙微波脈沖序列的電子自旋回波（ESE）強度隨磁場變化的函數來記錄 EPR 光譜的吸收線形。微波脈沖的持續時間分別為 50 和 70 ns，微波脈沖之間的典型間隔時間為 150-300 ns。

數據處理

使用 Xepr（Bruker BioSpin）和 Matlab 7.11.1（MathWorks）環境進行。磁性參數從 EPR 光譜的理論模擬中獲得。模擬使用 EasySpin 軟件包（版本 4.0.0）進行。確定多頻 EPR 光譜組的電子 g 張量的精度估計為 ±0.001（相對值）。請注意，取決于樣品位置磁場校準的絕對誤差更大。

用于 EPR 測量的生物雜交物溶液在 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）中制備，加入 100 mmol L-1 NaCl 和 10% 甘油，并在手套箱中引入 4-mm 外徑石英管中。自旋定量通過比較在非飽和條件下記錄的光譜的積分強度與在非飽和條件下記錄的 MTSL 自旋標記溶液的光譜的積分強度來進行。