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Co K 吸收邊（7.709 keV）X 射線吸收近邊結(jié)構(gòu)（XANES）和擴(kuò)展 X 射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)（EXAFS）光譜在阿貢國家實(shí)驗(yàn)室先進(jìn)光子源的 12BM 光束線收集。單色儀中使用 Si（111）雙晶。使用鍍鉑鏡聚焦光束并去除高次諧波 X 射線光子。樣品處的光束尺寸約為 0.4 mm（垂直）x 1 mm（水平）。使用反饋系統(tǒng)控制單色儀晶體角度，并設(shè)置為 70% 失諧。使用 13 元素鍺固態(tài)檢測器（Canberra）收集鐵 X 射線熒光信號(hào)。在檢測器前放置鐵過濾器以衰減彈性散射，這將樣品的熒光與彈性散射的信號(hào)比從 <1:100 增加到 ~1:1。檢測器放大器的輸出連接到單通道分析器（SCA）陣列，其上下閾值設(shè)置僅允許 Ka1 和 Ka2 熒光信號(hào)進(jìn)一步處理。在樣品前放置電離室用于入射 X 射線通量參考信號(hào) I0，第二和第三個(gè)電離室放置在樣品后。插入第二和第三個(gè)電離室之間的鈷箔用于能量校準(zhǔn)。SCA 的輸出信號(hào)連接到標(biāo)量陣列，該陣列與托管數(shù)據(jù)采集程序的計(jì)算機(jī)（G. Jennings，阿貢國家實(shí)驗(yàn)室）接口。在 20 K 下進(jìn)行 X 射線吸收光譜測量時(shí)，使用 Tris-HCl 緩沖液和甘油（10%）的混合物防止冰晶形成。配合物 1 在乙腈溶液中測量，樣品溶液在 20 K 的低溫恒溫器（Janis 型號(hào) CCS-150）內(nèi)研究。
所有電化學(xué)測量均在室溫下在氮?dú)鈿夥障逻M(jìn)行。使用標(biāo)準(zhǔn)的三電極配置，包括基于 CNT 的工作電極（見下文）、輔助鉑絲和 Ag/AgCl/飽和 AgCl 水溶液 + 3 mol L-1 KCl（在本文中表示為 Ag/AgCl）參比電極，由 Vycor 熔塊封閉并直接浸入溶液中。然后使用 [Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4- 電對(duì)（E0 = 0.215 V vs Ag/AgCl 或 0.425 V vs SHE，在 pH 7 磷酸鹽緩沖液中）用于水溶液中的測量標(biāo)準(zhǔn)化。Fc+/Fc 電對(duì)（E0 = 0.45 V vs Ag/AgCl）在電解質(zhì)溶液為 0.1 mol L-1 nBu4NBF4/CH3CN 時(shí)用作參比。循環(huán)伏安圖使用 Biologic SP300 恒電位儀記錄。H2 釋放使用連接到 Unisense 氫氣微電極，用 100%、40% 和 10% H2 飽和的去離子水校準(zhǔn)。輻照使用 300 W 氙燈（Oriel，無臭氧）在 280 W 下運(yùn)行，并耦合充滿水的 Spectra-Physics 6123NS 液體過濾器以消除紅外輻射，對(duì)于使用釕基光敏劑的實(shí)驗(yàn)，使用 Spectra-Physics 59472 紫外截止濾光片（λ > 400 nm）。
理論計(jì)算。 孤立鈷配合物的計(jì)算采用量子化學(xué)（QC）密度泛函理論（DFT）方法，使用 B3LYP 泛函和三 ζ 基組 def2-TZVP。所有電子結(jié)構(gòu)計(jì)算均使用 ORCA 程序包進(jìn)行。所有幾何優(yōu)化均使用適用于乙腈的隱式溶劑模型 COSMO 方法進(jìn)行。
對(duì)接計(jì)算使用分子力學(xué)（MM）和混合 QC/MM 勢能的混合物，使用 pDynamo 建模程序進(jìn)行。蛋白質(zhì)的起始結(jié)構(gòu)取自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（SwMb PDB 代碼 1UPD），去除所有非蛋白質(zhì)基團(tuán)，并使用 ProPKA 為適當(dāng)?shù)臍埢峙滟|(zhì)子化狀態(tài)。鈷配合物的結(jié)構(gòu)從先前進(jìn)行的 DFT 計(jì)算中獲得。對(duì)接的初始結(jié)構(gòu)通過將鈷配合物放置在蛋白質(zhì)輔基空出的位點(diǎn)中獲得，Co-NHis 距離為 2.5 ?。然后使用幾何優(yōu)化和分子動(dòng)力學(xué)模擬的混合物，結(jié)合 OPLS-AA MM 力場，對(duì)這些初始結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化。模擬中，配合物 5 ? 內(nèi)的所有殘基原子可以自由移動(dòng)，而距離超過 5 ? 的蛋白質(zhì)殘基原子則被諧波約束在其原始位置。Co-NHis 距離被諧波約束在 2.5 ?。優(yōu)化在配合物繞 Co-NHis 軸每 10° 增量進(jìn)行，所得結(jié)構(gòu)根據(jù)其能量排序。對(duì)水在鈷遠(yuǎn)端配位的情況（Co-O 水距離諧波約束在 1.9 ?）進(jìn)行了類似的計(jì)算。然后使用半經(jīng)驗(yàn) PM6 方法和上述相同的 OPLS-AA 力場對(duì)最低能量 MM 優(yōu)化結(jié)構(gòu)進(jìn)行 QC/MM 計(jì)算。QC 區(qū)域包含鈷配合物、配位組氨酸的側(cè)鏈（CH2 咪唑基團(tuán)），以及如果存在，水。使用此勢能的優(yōu)化以與 MM 優(yōu)化相同的方式進(jìn)行，但沒有鈷與配位組氨酸和水基團(tuán)之間的諧波約束，因?yàn)檫@些相互作用現(xiàn)在在 QC 理論水平上處理。
生物雜交物 SwMb·1 的制備。 生物雜交物在手套箱中在濕的氮?dú)夥障掠?18°C 制備。將 1 的溶液（500 μL, 1 mmol L-1）在 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）中緩慢加入 SwMb 的溶液（500 μL, 1.7 mg mL-1 或 0.1 mmol L-1）中。將黃色溶液在 4°C 下攪拌 1 小時(shí)，轉(zhuǎn)移到 NAP10 脫鹽柱，并用相同緩沖液洗脫。收集黃色蛋白質(zhì)級(jí)分（1 mL, 0.76 mg mL-1 或 0.45 mmol L-1；產(chǎn)率 90%）并在整個(gè)研究過程中保持在惰性氣氛下，除非另有說明。
生物雜交物 SwMb·2 的制備。 生物雜交物在手套箱中在濕的氮?dú)夥障掠?18°C 制備。將 2 的溶液（500 μL, 1 mmol L-1）在 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）中緩慢加入 SwMb 的溶液（500 μL, 3.6 mg mL-1 或 0.2 mmol L-1）中。將黃色溶液在 4°C 下攪拌 1 小時(shí)，轉(zhuǎn)移到 NAP10 脫鹽柱，并用相同緩沖液洗脫。收集黃色蛋白質(zhì)級(jí)分（1 mL, 1.2 mg mL-1 或 0.7 mmol L-1；產(chǎn)率 66%）并在整個(gè)研究過程中保持在惰性氣氛下，除非另有說明。
修飾的 CNT 電極的制備。 將 MWCNTs（29 mg）在無水乙醇（210 mL）中的懸浮液通過超聲均勻化。連續(xù)將 10 μL 等分試樣沉積到 Teflon 包埋的玻碳電極（5 mm 外徑）上，直到電活性表面完全覆蓋。電極在空氣中干燥，然后將一滴（15 μL）蛋白質(zhì)溶液沉積到 MWCNTs 的表面上。在空氣中干燥后，最終加入 Nafion 溶液（15 μL）。
使用銪（II）鹽的催化測定。 制備在手套箱中在濕的氮?dú)夥障掠?18°C 進(jìn)行。從等體積的 EuCl2 和 EGTA 儲(chǔ)備溶液（400 mmol L-1）制備 [Eu(EGTA)(H2O)]2-（200 mmol L-1）在 1 mol L-1 Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液中的溶液。生物雜交物（SwMb·1 或 SwMb·2）溶液由 SwMb 溶液（通常 100 μL, 0.1 mmol L-1）在 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液中和 1 或 2 的溶液（10 μL, 0.8 mmol L-1）在去離子水中原位制備；特意略微不足化學(xué)計(jì)量地引入 1 或 2 以確保與蛋白質(zhì)完全結(jié)合。將該溶液轉(zhuǎn)移到 Unisense 400 μL 微型呼吸室中，從手套箱中取出，并將氫氣微電極浸入溶液中。一旦信號(hào)穩(wěn)定 10 分鐘，通過 Hamilton 注射器加入銪（II）溶液。
光催化測定。 制備在手套箱中在濕的氮?dú)夥障掠?18°C 進(jìn)行。[Ru(bipy)3]Cl2（10 mmol L-1）和 DAF（1.4 mmol L-1; E400 nm = 12000 mol-1 L cm-1）的溶液在去離子水中制備。生物雜交物（SwMb·1 或 SwMb·2）溶液由 SwMb 溶液（通常 100 μL, 0.1 mmol L-1）在 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液中和 1 或 2 的溶液（10 μL, 0.8 mmol L-1）在去離子水中原位制備；特意略微不足化學(xué)計(jì)量地引入 1 或 2 以確保與蛋白質(zhì)完全結(jié)合。
在基于 [Ru(bipy)3]Cl2 作為光敏劑的實(shí)驗(yàn)中，用補(bǔ)充了 NaCl（150 mmol L-1）和抗壞血酸鈉（100 mmol L-1）的 50 mmol L-1 磷酸鉀（pH 6）緩沖液稀釋生物雜交物溶液。然后將溶液轉(zhuǎn)移到 Unisense 400 μL 微型呼吸室中，從手套箱中取出，并將氫氣微電極浸入溶液中。一旦信號(hào)穩(wěn)定 10 分鐘，通過 Hamilton 注射器加入 [Ru(bipy)3]Cl2 溶液（相對(duì)于鈷催化劑 20 當(dāng)量），并開始照射。
在基于 DAF 作為光敏劑的實(shí)驗(yàn)中，用 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液稀釋生物雜交物溶液。然后將溶液轉(zhuǎn)移到 Unisense 400 μL 微型呼吸室中，從手套箱中取出，并將氫氣微電極浸入溶液中。一旦信號(hào)穩(wěn)定 10 分鐘，通過 Hamilton 注射器加入 DAF 溶液（相對(duì)于鈷催化劑 0.5 當(dāng)量），并開始照射。
