摘要

脈絡叢上皮細胞位于腦室中，產生大部分腦脊液。通過確定電致性 Na+-HCO3- 協同轉運蛋白 NBCe2 對腦脊液 pH 調節的貢獻，驗證了正常大腦功能是通過脈絡叢上皮細胞介導的酸-堿當量排出以調節腦脊液 pH 來維持的假說。我們生成并驗證了一種新的 NBCe2 基因敲除小鼠品系。與對照小鼠相比，NBCe2 敲除小鼠脈絡叢上皮細胞的細胞內堿化后的堿排出率降低了 77%。在高碳酸血癥誘導的酸中毒期間，NBCe2 敲除小鼠和脈絡叢上皮細胞靶向性 NBCe2 siRNA 敲低小鼠的腦脊液 pH 恢復分別減少了約 85% 和 90%。NBCe2 敲除不影響基線呼吸頻率或潮氣量，且 NBCe2 敲除和野生型小鼠對暴露于 5% CO2 表現出相似的呼吸反應。NBCe2 敲除小鼠在藥理或加熱誘導的癲癇發作發展中未受到保護。總之，我們通過證明 NBCe2 對于高碳酸血癥誘導的酸中毒后適當的腦脊液 pH 恢復是必要的，從而確立了脈絡叢上皮細胞參與腦脊液 pH 調節的概念。

引言

中樞神經系統內的正常神經元功能依賴于穩定且合適的內部物理化學環境，其中細胞間隙 pH 是決定神經元興奮性的重要參數之一。大腦 pH 值的紊亂會由于支配細胞電學特性的膜蛋白質子化狀態的改變而影響神經元功能，因此嚴重的酸中毒會導致意識模糊、昏迷并最終死亡，而大腦堿中毒則會導致驚厥，例如熱性驚厥。糾正酸堿紊亂的主要調節系統是肺通氣（控制 PCO2）和腎臟對酸-堿當量的排泄（即凈 NH4+、H+ 或 HCO3- 分泌）的變化。通氣反應主要依賴于感知大腦間質液中 PCO2 和 H+ 的中樞化學感受器。

血-腦屏障和血-腦脊液屏障對 CO2 具有高滲透性，但對 H+ 和 HCO3- 的滲透性則低得多。因此，動脈 PCO2 的增加能被中樞化學感受器快速感知，從而能夠對高碳酸血癥做出快速的呼吸反應。然而，許多經典研究也表明，在代謝性酸-堿紊亂期間血液 pH 的急性變化會傳遞到腦脊液。因此，盡管腦脊液 PCO2 快速跟隨血漿 PCO2，但跨血-腦屏障和血-腦脊液屏障的上皮離子轉運使得腦脊液內的 [HCO3-] 能夠抵消 PCO2 的變化，從而即使在血漿 [HCO3-] 沒有變化的情況下也能恢復腦脊液 pH 值。在狗身上，Kazemi 及其同事表明，盡管血漿 pH 值較低，但在吸入 10% CO2 后 6 小時內腦脊液 pH 值恢復正常，這表明腦脊液盡管其蛋白質緩沖物含量低，但通過去除酸或輸入堿當量（如 HCO3- 進入腦脊液）可以有效防止酸-堿紊亂。脈絡叢上皮細胞被認為介導了 H+ 和 HCO3- 從血液到腦脊液的轉運，以響應酸-堿紊亂。它通過將 HCO3- 從血液轉運到腦脊液或通過從頭合成 HCO3- 以排出到腦脊液來實現這一點。血-腦脊液屏障（即脈絡叢上皮細胞）主動將 HCO3- 擠出到腦脊液中，最早由 Maren 提出作為呼吸性酸中毒的補償機制。盡管有明確跡象表明脈絡叢上皮細胞在腦脊液 pH 調節中發揮作用，但這種現象背后的分子機制仍不清楚。

脈絡叢上皮細胞位于四個腦室中的每一個，這個非常活躍的上皮單層是腦室內腦脊液的主要來源。脈絡叢上皮細胞含有許多參與電解質和水分泌的膜轉運蛋白，并表達多種其他參與酸-堿當量跨質膜運動的蛋白質。在管腔（面向腦脊液）質膜中表達的轉運蛋白中，電致性 Na+-HCO3- 協同轉運蛋白 NBCe2 是已知的唯一堿排出蛋白。已知 NBCe2 以 1:3 的化學計量比將 Na+ 和 HCO3- 從上皮細胞輸出到腦脊液。NBCe2 的定位和轉運方向使其成為大腦酸中毒期間維持腦脊液 pH 值的明顯候選者。在基底外側膜，Na+ 依賴性 Cl-/HCO3- 交換蛋白 Ncbe 從血液側輸入 Na+ 和 HCO3-。陰離子交換蛋白 AE2 也在基底外側膜表達，負責從細胞中排出 HCO3-。電中性 Na+-HCO3- 協同轉運蛋白 NBCn1 也在脈絡叢上皮細胞中表達，但該轉運蛋白的膜定位在物種間有所不同。它將 Na+ 與 HCO3- 一起轉運到細胞內。在管腔膜中，Na+/H+ 交換蛋白 NHE1 將 H+ 從細胞中排出以交換 Na+。這些轉運蛋白對腦脊液 pH 調節的貢獻仍有待量化。

先前有兩項研究調查了小鼠中基因刪除 NBCe2 的后果。在 Kao 等人的研究中，通過插入靶向上游的外顯子 15 的基因陷阱載體實現了 Slc4a5 缺失。在 Groger 等人的研究中，通過插入靶向外顯子 7 的 loxP 位點刪除了 Slc4a5。在這兩種情況下，移碼突變和隨后的最終 NBCe2 蛋白截斷導致了 NBCe2 的缺失。Slc4a5 缺失導致的結果在這兩種模型之間存在差異。在 Kao 等人的研究中，免疫組織化學分析顯示電中性 Na+-HCO3- 協同轉運蛋白 Ncbe 的表達被打亂。該蛋白通常只在基底外側膜表達，但在 NBCe2 敲除中，Ncbe 在兩個膜中都有表達。此外，還觀察到 Na+,K+-ATP 酶亞基表達的顯著變化：在 NBCe2 敲除小鼠的脈絡叢上皮細胞中，發現 a1 亞基存在于基底外側膜以及管腔膜中。β2 亞基在 NBCe2 敲除的脈絡叢上皮中缺失。

在敲除小鼠中，觀察到管腔 Na+-K+-2Cl- 協同轉運蛋白 NKCC1 和細胞骨架蛋白 spectrin βII 在細胞內和管腔都有表達。這些蛋白質大多參與脈絡叢上皮細胞分泌腦脊液，并且確實在該研究中腦室容積和顱內壓顯著降低。電解質分析顯示，NBCe2 敲除小鼠的腦脊液 [HCO3-] 降低，表明腦脊液的酸-堿調節存在缺陷。注射驚厥劑戊四氮顯示，NBCe2 敲除小鼠對化學誘導的癲癇發作敏感性較低。與這些發現相反，Groger 等人未檢測到腦室容積的差異，表明該小鼠模型的 NBCe2 敲除表型不太嚴重。該研究未調查脈絡叢上皮細胞轉運蛋白的分布和腦脊液的電解質組成。然而，腦室表型的差異表明兩種敲除模型之間存在顯著差異，這可能歸因于基因靶向策略的差異。兩種技術都導致了經過驗證的移碼和所得蛋白質的截斷。基因陷阱插入導致表達相對較大的非功能性 NBCe2 蛋白，包括可能干擾其他脈絡叢上皮細胞蛋白表達的第一個跨膜結構域。外顯子 7 缺失方法可能存在表達選擇性剪接的 NBCe2 形式的風險，但 NBCe2 敲除的質譜分析似乎排除了這種可能性。在不知道差異的確切原因以及哪種敲除模型最可能反映 NBCe2 功能的情況下，似乎有必要建立一種新的 NBCe2 缺失小鼠模型，以避免截短和剪接變體的可能性。

在本研究中，我們生成了一個靶向 NBCe2 保守的第一個跨膜片段的敲除模型。這防止了信號肽介導的向粗面內質網的轉移。截短蛋白插入膜的過程受到阻礙，這一點通過使用針對 NBCe2 N 末端的新型抗體得到了驗證。我們假設，脈絡叢上皮細胞中通過 NBCe2 的 HCO3- 轉運是面對急性呼吸性酸中毒時調節腦脊液 pH 的主要分子機制。我們利用通過 Cre-Lox 系統生成的新型 NBCe2 敲除小鼠，以及靶向的 siRNA NBCe2 敲低方法，來研究 NBCe2 在調節和維持脈絡叢上皮細胞和腦脊液 pH 中的作用。我們表明，敲除 NBCe2 可降低脈絡叢上皮細胞在細胞內堿化后恢復期間的堿排出率。

在 NBCe2 敲除和 NBCe2 敲低小鼠體內進行的腦脊液 pH 腦室內記錄表明，NBCe2 對于維持腦脊液 pH 從高碳酸血癥誘導的酸化中恢復是必要的。因此，我們建議通過 NBCe2 排出 HCO3- 作為對脈絡叢上皮細胞局部補償性調節腦脊液 pH 的第一個機制性見解。了解參與腦脊液堿化及其調節的分子機制，可能在臨床需要藥物方法調整腦脊液 pH 的情況下（例如在癲癇發作或酸堿紊亂期間）證明是有益的。