方法

倫理批準

所有動物實驗均符合國家實驗室動物護理和使用指南，并且所有實驗方案均獲得國家機構丹麥動物實驗檢查委員會的批準。實驗在 C57BL/6 小鼠中進行。除非另有說明，僅使用 8-12 周齡的雄性小鼠。小鼠隨意進食嚙齒動物顆粒飼料，自由飲用自來水，并飼養在溫控房間中，光照-黑暗周期為 12 小時:12 小時。所有小鼠在實驗結束后通過頸椎脫臼法處死。研究人員遵守《生理學雜志》要求的倫理原則和動物檢查表。

全局 Slc4a5 敲除小鼠的生成

通過將跨越 Slc4a5 基因序列的 PCR 擴增基因組 DNA 片段插入修飾的 pKO Scrambler 載體來生成用于創建“floxed” Slc4a5 基因的靶向構建體。將靶向構建體線性化并電穿孔到源自 129S1/Sv 小鼠的 CJ7 胚胎干細胞中。選擇并擴增具有 G418 抗性的克隆。通過使用側接靶向構建體序列的探針進行 Southern 印跡來鑒定具有同源重組的克隆。為了生成條件性 floxed Slc4a5TM1Emfu 等位基因，通過用 FLP 重組酶表達質粒瞬時轉染靶向的胚胎干細胞，刪除了兩側有 FRT 位點的新霉素磷酸轉移酶表達盒。通過使用篩選引物擴增基因組片段產生的探針進行 Southern 印跡來驗證新霉素敏感克隆。在以下部分中，這稱為 Slc4a5flx 等位基因。

通過將胚胎干細胞注射到 B6D2F2 小鼠囊胚中來生成嵌合小鼠。將嵌合雄鼠與 C57BL/6 雌鼠交配，并通過 PCR 使用基因組尾 DNA 和引物 L1 和 R 分析其皮毛呈野鼠色（表明經過操作的 129S1/Sv 胚胎干細胞發生種系傳遞）的后代是否存在 Slc4a5flx 突變。野生型等位基因的預期產物為 111 bp，Slc4a5flx 等位基因的預期產物為 133 bp。

通過將攜帶 Slc4a5flx 等位基因的小鼠與它莫昔芬誘導的泛素啟動子驅動的 Cre 重組酶表達小鼠品系 B6.Cg-Tg 交配，獲得 Slc4a5TM1.1Emfu 敲除等位基因。用溶于葵花籽油中的它莫昔芬腹腔注射誘導 Cre 重組酶表達，隨后用雌性小鼠進行繁殖，以獲得完全 NBCe2 敲除、雜合子 NBCe2 和野生型小鼠。缺失外顯子 13 的 Slc4a5TM1.1Emfu 等位基因在下文中稱為 Slc4a5delE13。使用引物對 L2 和 R 檢測到 Slc4a5delE13 為 188 bp 的 PCR 產物。因此，實驗中使用的所有小鼠都具有混合的 C57Bl/6J-129S1/Sv 遺傳背景，因此在整個研究中使用同窩仔與 NBCe2 敲除小鼠進行比較。

基因分型

通過尾活組織檢查的基因組 DNA 的聚合酶鏈反應來確定所有同窩仔的基因型。將尾巴在 25 mM NaOH 和 0.2 mM EDTA 中 95°C 煮沸 30 分鐘，然后加入等體積的 40 mM Tris-HCl。對于 PCR 反應，將總計 20% 的含 DNA 溶液與 5 pmol 的每種引物和 5x FIREPol Blend Master Mix 混合。在 95°C 激活 5 分鐘后，進行 30 個循環的 PCR：95°C 變性 30 秒，58°C 退火 30 秒，72°C 延伸 1 分鐘。用含有 0.05% 10000x GelRed 核酸凝膠染料的 DNA 凝膠上樣染料對 PCR 產物進行可視化。

抗 NBCe2 抗體

使用對應于小鼠 NBCe2 N 端結構域中氨基酸殘基 162 至 177 的 16 個氨基酸肽（N 端帶有半胱氨酸）對兔子進行免疫，并產生滴度高于 1:512,000 的抗血清。將抗體用與瓊脂糖柱偶聯的免疫肽進行親和純化。

通過免疫細胞化學法驗證抗體在表達 NBCe2 的細胞培養物中的特異性。用野生型 NBCe2 質粒轉染 Flp-In-3T3 細胞，并用潮霉素 B 進行篩選。細胞在補充了供體牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培養基中，在 37°C、5% CO2 條件下培養。

用 PBS 洗滌 NBCe2 轉染的細胞，并用 4% 多聚甲醛浸泡固定。用 0.2% 皂苷透化細胞 10 分鐘，并用血清溶液和明膠溶液封閉多余結合位點。然后將細胞在 4°C 下與一抗孵育過夜。使用偶聯 Alexa Fluor 488 的山羊抗兔抗體進行可視化。

免疫印跡

從 NBCe2 敲除和野生型小鼠的大腦中分離脈絡叢，并轉移到樣品緩沖液中。將樣品超聲處理，并在 65°C 加熱 15 分鐘。將樣品上樣到 4-12% 聚丙烯酰胺 SDS 凝膠上，并通過電泳分離。轉移至 PVDF 膜后，用含 5% 脫脂牛奶的 PBS-T 封閉膜。將膜在 4°C 下與一抗在 1% BSA、2 mM NaN3 的 PBS-T 中孵育過夜。洗滌后，將膜與二抗在室溫下孵育 1 小時。使用 ECL Plus 和化學發光數字分析儀對免疫反應性條帶進行可視化。