XANES測(cè)量

圖6顯示了兩種生物雜交物SwMb·1和SwMb·2在CoK吸收邊的XANES光譜，以及1（在乙腈溶液中記錄）和電化學(xué)生成的一電子氧化1+（CoIII）在CH3CN中記錄的光譜。后兩者的比較表明，當(dāng)CoII被氧化為CoI時(shí)，以及當(dāng)配合物中的配位數(shù)增加時(shí)，會(huì)發(fā)生顯著的吸收邊向上移動(dòng)。與1的光譜相比，SwMb·1和SwMb·2的光譜中可以看到這種吸收邊能量藍(lán)移。然而，SwMb·1和SwMb·2的XANES光譜中的吸收邊能量仍然比1+（CoII）低約1eV。用CoII（50±10%）和CoIII（50±10%）物種的混合物模擬的光譜再現(xiàn)了在SwMb·1中觀察到的特征。這一結(jié)果與EPR數(shù)據(jù)一致，表明生物雜交物樣品中大約存在1:1的CoII和CoIII混合物。

圖6.（A）SwMb·1（黑色）、SwMb·2（藍(lán)色）、配合物1（綠色）和電化學(xué)生成的1+（CoIII，紅色）在CoK吸收邊的歸一化XANES光譜。（B）前吸收邊區(qū)域的放大圖。所有樣品的光譜在20K下收集，除了1+在室溫下收集。

同時(shí)，圖6中聚焦于前吸收邊區(qū)域的插圖清楚地顯示，與鈷（III）配合物相比，鈷（II）配合物中四極允許的1s→3dx2-y2躍遷強(qiáng)度更高。前者有兩個(gè)前吸收邊特征，而后者只有一個(gè)弱特征（圖6B）?；谒臉O允許躍遷的性質(zhì)，可以推斷出（i）鈷（III）很可能是低自旋物種，只有一個(gè)（或一組）空3d軌道和近乎對(duì)稱的八面體幾何結(jié)構(gòu)，以及（ii）鈷（II）的配位幾何結(jié)構(gòu)對(duì)稱性較低，具有高自旋態(tài)，顯示至少兩個(gè)空3d軌道能級(jí)。兩種生物雜交物的前吸收邊區(qū)域強(qiáng)度低于1（圖6A,B中的插圖），表明生物雜交物中的配位球更對(duì)稱。

然而，在1的低溫?cái)?shù)據(jù)中沒(méi)有第二個(gè)前吸收邊特征的跡象，表明1（3d7）在20K時(shí)具有低自旋態(tài)，只有一組空且?guī)缀醯饶艿?d軌道。這種依賴于溫度的自旋態(tài)形成在鐵物種中常見(jiàn)。更高的前吸收邊強(qiáng)度也表明1中存在一些3d-4p混合，但生物雜交物中的這種混合減少，這可能是因?yàn)楫?dāng)鈷（II）和鈷（III）物種結(jié)合到蛋白質(zhì)基質(zhì)時(shí)，都獲得了更對(duì)稱的配位球，很可能是八面體幾何結(jié)構(gòu)。

結(jié)構(gòu)研究

EXAFS

圖7顯示了兩種生物雜交物SwMb·1和SwMb·2的EXAFS和傅里葉變換EXAFS光譜，以及1的光譜。圖7（頂部）顯示的振蕩幅度表明，與1相比，生物雜交物樣品中與鈷中心配位的最近鄰原子數(shù)可能增加，和/或最近鄰距離更均勻。除了鈷配位數(shù)可能增加外，在將1插入SwMb時(shí)，在鈷中心與第一個(gè)配位原子之間的距離方面沒(méi)有觀察到重大的結(jié)構(gòu)變化。從1的傅里葉變換光譜（圖7（底部））可以得出相同的信息，其中最高峰對(duì)應(yīng)于最近的Co-N或Co-O距離，即四個(gè)赤道配體以及一個(gè)或兩個(gè)軸向配體。在SwMb·1和SwMb·2的光譜中，該峰的強(qiáng)度明顯高于1的光譜，表明配位數(shù)增加（歸因于His93，見(jiàn)下文）和/或鈷中心與赤道和軸向配體之間的鍵距更均勻。

圖7.（頂部）SwMb·1（黑色）、SwMb·2（藍(lán)色）和配合物1（綠色）的k3加權(quán)EXAFS光譜。（底部）相應(yīng)的傅里葉變換幅度。所有光譜在20K下記錄。

圖8.SwMb·1（{Co(dmgBF2)2}部分，綠色）和SwMb·2（{Co(dmgH)2}部分，紫色）生物雜交物中鈷配合物結(jié)合位點(diǎn)的疊加。來(lái)自多肽鏈，僅表示了His93（底部）和His64（頂部）。

對(duì)接

最初使用MM能量函數(shù)進(jìn)行對(duì)接計(jì)算，以確定{Co(dmgBF2)2}和{Co(dmgH)2}部分在SwMb腔內(nèi)可能的容納情況。His93與兩個(gè)部分的鈷中心的配位明顯比與腔內(nèi)存在的其他組氨酸（His64）殘基的配位更穩(wěn)定。根據(jù)此模型，一個(gè)軸向水分子在His93的反位配位，并使用QC/MM勢(shì)能優(yōu)化系統(tǒng)，QC區(qū)域包含鈷配合物和配位組氨酸的側(cè)鏈。圖8顯示了兩種生物雜交物中圍繞金屬中心的優(yōu)化結(jié)構(gòu)的疊加。這些結(jié)構(gòu)的其他表示顯示在圖9。

圖9.SwMb·1（a）和SwMb·2（b）中鈷配合物結(jié)合位點(diǎn)的表示，基于QC/MM對(duì)接計(jì)算。鈷原子顯示為球體（SwMb·1中為綠色，SwMb·2中為紫色）。蛋白質(zhì)殘基顯示為細(xì)線，水分子顯示為紅色球體，氫鍵顯示為黑色虛線。

在該理論水平上，沒(méi)有觀察到軸向配體（水或His93）的解離。在SwMb·2的情況下，在配位的水分子和His64之間建立了氫鍵（N···H距離為2.02?）。在SwMb·1的情況下沒(méi)有形成這種相互作用，因?yàn)檩^大的配合物1配體將His64位移出氫鍵范圍。表2收集了兩種生物雜交物的優(yōu)化結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，并將其與結(jié)構(gòu)表征的[Co(dpgBF2)2(CH3CN)2]和[Co(dmgH)2pyI]配合物的文獻(xiàn)值進(jìn)行比較。這些數(shù)據(jù)與從EXAFS實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論完全吻合。

表 2. SwMb·1 和 SwMb·2 的模擬（對(duì)接數(shù)據(jù)）以及 [Co(dmgBF2)2(CH3CN)] 在乙腈隱式溶劑模型中使用 B3LYP 泛函和 TZVP 基組的 DFT 計(jì)算，以及實(shí)驗(yàn)（Co K 吸收邊 EXAFS）或鈷肝 X 射線結(jié)構(gòu)的第一鄰近原子鍵長(zhǎng)。