摘要

微電極陣列是用于以多通道格式研究心肌細(xì)胞細(xì)胞外電生理學(xué)的重要工具。然而，它們通常缺乏記錄細(xì)胞內(nèi)動作電位的能力。最近的研究依賴于結(jié)合電穿孔的高分辨率微電極的昂貴制造來進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)記錄，但微電極尺寸對微電穿孔和細(xì)胞內(nèi)信號采集質(zhì)量的影響尚未被探索。了解這些效應(yīng)可以促進(jìn)各種尺寸微電極的設(shè)計，以實現(xiàn)更低成本的制造工藝。在本研究中，我們通過模擬和實驗研究了微電極尺寸對微電穿孔后細(xì)胞內(nèi)動作電位參數(shù)和記錄指標(biāo)的影響。

我們使用標(biāo)準(zhǔn)光刻技術(shù)制造了不同尺寸的微電極，通過耦合微電穿孔記錄來自不同培養(yǎng)環(huán)境的心肌細(xì)胞動作電位。我們的研究結(jié)果表明，較大的微電極通常記錄到的電生理信號幅度更高，信噪比更好，而較小的電極則表現(xiàn)出更高的穿孔效率、動作電位持續(xù)時間和單細(xì)胞信號比例。這項工作表明，微電穿孔技術(shù)可以應(yīng)用于較大的微電極進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)記錄，而不僅限于高分辨率設(shè)計。這種方法可能為使用替代性低成本制造技術(shù)制造微電極以進(jìn)行高質(zhì)量細(xì)胞內(nèi)動作電位記錄提供新的機會。

引言

記錄具有電生理特性的細(xì)胞的動作電位對于理解亞細(xì)胞功能原理和推進(jìn)藥物開發(fā)具有重要意義。這對于心肌細(xì)胞尤其如此，因為與細(xì)胞外場電位相比，動作電位信號提供了更豐富的細(xì)胞功能信息。動作電位持續(xù)時間、去極化速率和復(fù)極化時間等關(guān)鍵參數(shù)是心肌細(xì)胞心律失常的重要預(yù)測因子。在心肌細(xì)胞的電生理監(jiān)測中，細(xì)胞外場電位反映了由于各種離子濃度疊加變化而附著在電極上的細(xì)胞簇的時空電活動。細(xì)胞外場電位信號揭示的關(guān)鍵電生理參數(shù)是場電位持續(xù)時間和搏動頻率。相比之下，細(xì)胞內(nèi)動作電位捕獲了心肌細(xì)胞在收縮過程中隨時間變化的膜電位變化，從而能夠量化快速去極化和復(fù)極化速率。此外，細(xì)胞內(nèi)動作電位的變化與心臟的興奮傳導(dǎo)和收縮功能直接相關(guān)。因此，可靠且高通量的方法來檢測細(xì)胞內(nèi)動作電位對于全面理解心臟發(fā)病機制和有效的藥物篩選至關(guān)重要。

膜片鉗技術(shù)被認(rèn)為是檢測細(xì)胞電信號的金標(biāo)準(zhǔn)，全細(xì)胞膜片鉗能夠測量細(xì)胞內(nèi)動作電位。此外，電壓敏感染料有助于觀察單個和多個心肌細(xì)胞的細(xì)胞動作電位。然而，膜片鉗方法通量低，并且可能對能夠測量細(xì)胞內(nèi)（信號）的全細(xì)胞膜片鉗造成不可逆的損傷，并且需要復(fù)雜的實驗裝置以及顯微鏡操作系統(tǒng)。使用微加工技術(shù)制造的微電極陣列能夠同時從多個細(xì)胞進(jìn)行長期記錄，并且允許直接在微電極陣列上培養(yǎng)細(xì)胞，增強了用戶友好性。

為了改善細(xì)胞-微電極耦合和電生理信號測量的質(zhì)量，已經(jīng)開發(fā)了具有納米結(jié)構(gòu)的被動和主動納米級電極陣列。細(xì)胞膜與納米電極的緊密接觸減少了間隙，從而增強了封接阻抗，并產(chǎn)生高質(zhì)量的細(xì)胞外場電位記錄。雖然微電極陣列通常由于與細(xì)胞膜的非侵入性接觸而只能檢測細(xì)胞外場電位，但具有三維納米結(jié)構(gòu)的微電極已被用于捕獲能提供更詳細(xì)信息的細(xì)胞內(nèi)電生理信號。例如，用磷脂分子修飾的納米尖端和納米線微電極可以穿透心肌細(xì)胞以進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)動作電位記錄。然而，無論是通過重力還是化學(xué)修飾，這種穿孔是隨機的，并可能導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞損傷。

因此，更可靠的細(xì)胞穿孔方法可以通過局部穿孔與物理力相結(jié)合來實現(xiàn)，從而能夠以低阻抗記錄細(xì)胞內(nèi)動作電位。Dipalo等人報道了使用激光刺激3D等離子體納米電極和模糊石墨烯微電極進(jìn)行細(xì)胞膜穿孔，允許進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)動作電位檢測。然而，耦合激光進(jìn)行光穿孔需要一個復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)，并且由于細(xì)胞膜光穿孔基于光熱效應(yīng)，對微電極陣列微電極的材料要求更為嚴(yán)格。生物電子平臺已經(jīng)證明，施加脈沖電壓有可能使細(xì)胞產(chǎn)生可逆的納米孔，這可以實現(xiàn)額外的功能，例如細(xì)胞轉(zhuǎn)染或細(xì)胞電位檢測。

例如，Wu等人使用直流刺激來增強轉(zhuǎn)染細(xì)胞中愈合因子的分泌并加速腸道愈合。Jahed等人提出，垂直排列的納米冠電極結(jié)合電穿孔可以連續(xù)多天記錄細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)動作電位。相比之下，電穿孔與電信號檢測系統(tǒng)更兼容，因為微電極不僅可以作為電信號檢測的媒介，還可以發(fā)射電脈沖用于細(xì)胞膜電穿孔。

為了檢測單個細(xì)胞內(nèi)的動作電位，通常在使用微/納制造技術(shù)絕緣電極后獲得直徑小于10微米的微電極。Viswam等人使用小于10微米的微電極陣列電極探測了局部場電位和細(xì)胞外動作電位。較小的電極需要更高的加工精度，這使得微/納制造過程更加復(fù)雜。雖然較小的電極與心肌細(xì)胞具有更高的封接電阻，這可以最大限度地減少電流泄漏并通過降低背景噪聲來提高信號質(zhì)量。較大的電極往往具有較低的阻抗，這可以減少熱噪聲并提高信噪比。

因此，如何平衡電極暴露區(qū)域的大小對于檢測細(xì)胞內(nèi)外電信號的質(zhì)量非常重要。雖然已經(jīng)檢測到單細(xì)胞電信號，但目前的研究主要集中在細(xì)胞-納米電極耦合對這些信號記錄的影響上。值得注意的是，缺乏研究探討微米級電極暴露區(qū)域在檢測心肌細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)動作電位方面的差異。因此，系統(tǒng)地研究電極尺寸如何影響信噪比、穿孔效率和動作電位持續(xù)時間等心肌細(xì)胞參數(shù)至關(guān)重要。

此外，在技術(shù)層面上，電極尺寸精度的降低使微電極陣列的加工更容易獲得，為研究人員在檢測細(xì)胞電信號方面提供了更大的靈活性。例如，可以使用諸如掩模版蒸發(fā)沉積、絲網(wǎng)印刷、噴墨印刷和激光蝕刻等技術(shù)，以通常大于20或100微米的精度制造電極。如果這些較大尺寸的電極能夠有效地穿透細(xì)胞膜并成功記錄細(xì)胞內(nèi)動作電位，那么微電極陣列的制備過程將變得更加多樣化和適應(yīng)性強。

在這項工作中，我們描述了不同微米尺寸的微電極對細(xì)胞內(nèi)動作電位信號質(zhì)量和細(xì)胞內(nèi)記錄指標(biāo)參數(shù)的影響。首先，我們通過無源電路模擬模型確定，在細(xì)胞膜阻抗降低后，使用平面電極記錄的心肌細(xì)胞電生理信號波形與細(xì)胞內(nèi)動作電位波形一致。接下來，通過三維模擬模型優(yōu)化了電穿孔電壓，并探討了電極尺寸對跨膜電壓、電流密度和電場強度的影響。在我們的實驗中，我們使用標(biāo)準(zhǔn)光刻工藝制造了不同尺寸的微電極陣列（包括混合尺寸微電極陣列和多尺寸微電極陣列）。

通過將這兩種類型的微電極陣列與微米電穿孔耦合，記錄了不同培養(yǎng)環(huán)境中心肌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)動作電位。對電生理信號的分析表明，電極的阻抗對細(xì)胞內(nèi)動作電位的幅度和信噪比影響更大。隨著微電極尺寸的增加，細(xì)胞內(nèi)動作電位的幅度和信噪比分別增加了高達(dá)220%和70%。跨膜電壓和電場強度更多地影響了穿孔效率、動作電位持續(xù)時間和記錄到的單細(xì)胞信號比例。隨著微電極尺寸的增加，穿孔效率、動作電位持續(xù)時間和記錄到的單細(xì)胞信號比例分別降低了高達(dá)18.8%、17.5%和19.5%。在3V的電穿孔電壓下，不同尺寸的微電極對心肌細(xì)胞的自調(diào)節(jié)沒有顯著影響。

這項工作表明，微電穿孔技術(shù)可以應(yīng)用于各種尺寸的微電極，實現(xiàn)超越高分辨率微電極限制的細(xì)胞內(nèi)記錄。通過使該技術(shù)適應(yīng)較大的微電極，為使用更具成本效益的制造方法制造能夠進(jìn)行高質(zhì)量細(xì)胞內(nèi)動作電位記錄的微電極提供了新的機會。這種方法有潛力增強基于微電極陣列的細(xì)胞內(nèi)記錄設(shè)備和實驗設(shè)置的靈活性。